Điện di gel – Phần 4

Buffers 
Các chất đệm trong điện di gel được sử dụng để cung cấp ion có dòng điện và duy trì pH ở một giá trị tương đối ổn định. Những bộ đệm này có rất nhiều ion trong chúng, điều này là cần thiết cho việc đi qua điện qua chúng. Một cái gì đó giống như nước cất hoặc benzen chứa vài ion, điều này không lý tưởng cho việc sử dụng điện di. [19] Có một số bộ đệm được sử dụng cho điện di. Phổ biến nhất đối với các axit nucleic Tris / Acetate / EDTA (TAE), Tris / Borate / EDTA (TBE). Nhiều bộ đệm khác đã được đề xuất, ví dụ: lithium borat, hầu như không bao giờ được sử dụng, dựa trên trích dẫn Pubmed (LB), iso điện histidine, pK phù hợp với bộ đệm hàng hóa, vv; trong hầu hết các trường hợp lý do chính đáng là hiện tại dòng điện thấp hơn (ít nhiệt) và hoặc phù hợp với điện di ion, kéo dài tuổi thọ của đệm. Borate là vấn đề; Borat có thể trùng hợp, và / hoặc tương tác với cis diols như những chất có trong RNA. TAE có dung lượng đệm thấp nhất nhưng cung cấp độ phân giải tốt nhất cho DNA lớn hơn. Điều này có nghĩa là một điện áp thấp hơn và nhiều thời gian, nhưng một sản phẩm tốt hơn. LB là tương đối mới và không có hiệu quả trong việc giải quyết các mảnh vỡ lớn hơn 5 kbp; Tuy nhiên, với độ dẫn điện thấp, có thể sử dụng điện thế cao hơn (lên đến 35 V / cm), có nghĩa là thời gian phân tích ngắn hơn cho điện di thường quy. Sự khác biệt giữa một cặp base có thể được giải quyết bằng gel agarose 3% với môi trường có độ dẫn điện cực thấp (1 mM Lithium borat). 

Hầu hết sự phân tách protein SDS-PAGE được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống đệm “không liên tục” (hay DISC) làm tăng đáng kể độ sắc nét của các dải trong gel. Trong quá trình điện di trong một hệ gel không liên tục, một gradient ion được hình thành trong giai đoạn đầu của quá trình điện di động khiến cho tất cả các protein tập trung vào một dãy sắc duy nhất trong một quá trình gọi là isotachophoresis. Tách các protein theo kích cỡ đạt được ở vùng “giải quyết” thấp hơn của gel. Gel xử lý thông thường có kích thước lỗ nhỏ hơn nhiều, dẫn đến hiệu ứng sàng lọc mà bây giờ xác định sự di động điện di của protein.

Hình dung 
Thông tin thêm: Gel điện di của axit nucleic § Hình dung, và điện di gel của protein § Hình dung
Sau khi quá trình điện di hoàn thành, các phân tử trong gel có thể bị nhuộm màu để chúng có thể nhìn thấy được. DNA có thể được hình dung bằng cách sử dụng ethidium bromide, khi được intercalated vào DNA, huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím, trong khi protein có thể được hình dung bằng cách sử dụng chất nhuộm bạc hoặc thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue. Các phương pháp khác cũng có thể được sử dụng để hình dung sự tách các thành phần của hỗn hợp trên gel. Nếu các phân tử được tách ra có chứa phóng xạ, ví dụ như trong một gel trình tự DNA, có thể ghi lại một bức xạ tự động. Hình ảnh có thể được lấy của gel, thường sử dụng một hệ thống Gel Doc.

Xử lý hạ lưu 
Sau khi tách, có thể sử dụng một phương pháp tách biệt bổ sung, như tập trung và SDS-PAGE. Gel sau đó sẽ được cắt thể chất, và các phức hợp protein được chiết xuất từ ​​mỗi phần riêng biệt. Mỗi chiết xuất sau đó có thể được phân tích, chẳng hạn như bằng cách lấy dấu vân tay khối peptide hoặc trình tự peptide de novo sau khi tiêu hóa trong gel. Điều này có thể cung cấp rất nhiều thông tin về các đặc tính của các protein trong một phức hợp.

Các ứng dụng
Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi tiêu hóa enzyme hạn chế, ví dụ: trong việc lập bản đồ hạn chế của ADN nhân bản.
Phân tích các sản phẩm PCR, ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc dấu vân tay di truyền
Tách DNA giới hạn gen trước khi chuyển miền Nam, hoặc RNA trước khi chuyển sang miền Bắc.
Điện di gel được sử dụng trong pháp y, sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh học và hóa sinh. Các kết quả có thể được phân tích định lượng bằng cách hiển thị gel với tia cực tím và một thiết bị hình ảnh gel. Hình ảnh được ghi lại bằng máy ảnh hoạt động bằng máy tính và cường độ của dải hoặc điểm quan tâm được đo và so sánh với tiêu chuẩn hoặc các điểm đánh dấu được tải trên cùng một gel. Việc đo lường và phân tích phần lớn được thực hiện bằng phần mềm chuyên dụng.

Tùy thuộc vào loại phân tích được thực hiện, các kỹ thuật khác thường được thực hiện kết hợp với các kết quả của điện di gel, cung cấp một loạt các ứng dụng trường cụ thể.

Axit nucleic 
Bài báo chính: Điện di gel của axit nucleic

Một gel agarose của một sản phẩm PCR so với một bậc thang DNA.
Trong trường hợp axit nucleic, hướng di chuyển, từ điện cực âm đến cực dương, là do điện tích âm tự nhiên xảy ra bởi xương sống đường phosphate. 

Các đoạn ADN sợi đôi tự nhiên hoạt động như thanh dài, do đó sự di chuyển của chúng qua gel liên quan đến kích cỡ của chúng hoặc, đối với các mảnh tuần hoàn, bán kính của chúng là sự xoay chuyển. Thông tư DNA như plasmid, tuy nhiên, có thể cho thấy nhiều dải, tốc độ di chuyển có thể phụ thuộc vào việc nó được thư giãn hoặc supercoiled. DNA đơn hoặc ARN có xu hướng gấp lại thành các phân tử có hình dạng phức tạp và di chuyển qua gel theo một cách phức tạp dựa trên cấu trúc bậc ba của chúng. Do đó, các tác nhân phá vỡ các liên kết hydro, chẳng hạn như sodium hydroxide hoặc formamide, được sử dụng để làm mất axit nucleic và khiến chúng hoạt động như các thanh dài. 

Điện di gel của ADN hoặc RNA lớn thường được thực hiện bằng điện di gel agarose. Xem trang “Phương pháp chấm dứt chuỗi” đối với một ví dụ về một gel trình tự DNA polyacrylamide. Đặc tính thông qua sự tương tác phối tử của các axit nucleic hoặc các mảnh vỡ có thể được thực hiện bằng điện di ái lực thay đổi vận động.

Điện di của các mẫu ARN có thể được sử dụng để kiểm tra ô nhiễm gen của gen và cũng như sự suy thoái RNA. RNA từ sinh vật nhân chuẩn cho thấy các dải khác biệt của rRNA 28 và 18 s, dải 28s có độ gấp đôi gấp đôi so với dải 18s. RNA thoái hóa có các dải được xác định ít hơn, có bề ngoài bị bẩn, và tỷ lệ cường độ nhỏ hơn 2: 1.

Leave a Reply

Your email address will not be published.