Phân tích
Trong các cột bằng tay đơn giản, chất rửa giải được thu thập trong các thể tích không đổi, được gọi là phân số. Càng giống các hạt càng nhiều, càng có nhiều khả năng chúng nằm trong cùng một phân số và không phải là riêng biệt. Các cột tiên tiến hơn khắc phục vấn đề này bằng cách liên tục theo dõi chất rửa giải.
Các phân số thu thập được thường được kiểm tra bằng các kỹ thuật quang phổ để xác định nồng độ của các hạt eluted. Kỹ thuật phát hiện phổ quang phổ là chỉ số khúc xạ (RI) và tia cực tím (UV). Khi tách các loài tương tự như quang phổ (như trong quá trình tinh chế sinh học), các kỹ thuật khác có thể cần thiết để xác định hàm lượng của mỗi phân. Nó cũng có thể phân tích dòng chảy eluent liên tục với các phép đo RI, LALLS, Multi-Angle Laser Scattering Mali, UV, và / hoặc độ nhớt.
SEC Chromatogram của một mẫu sinh học.
Khối lượng rửa giải (Ve) gần như tuyến tính giảm với logarit của khối lượng thủy phân phân tử. Cột thường được hiệu chuẩn sử dụng 4-5 mẫu tiêu chuẩn (ví dụ, các protein gấp có trọng lượng phân tử đã biết), và một mẫu chứa một phân tử rất lớn như thyroglobulin để xác định thể tích void. Các thể tích tách rửa của các tiêu chuẩn được chia cho thể tích rửa giải của thyroglobulin (Ve / Võ) và vẽ lên bảng so với trọng lượng phân tử của tiêu chuẩn (Blue Dextran không được khuyến cáo cho Void vì nó không đồng nhất và có thể cho kết quả khác nhau)
Các ứng dụng
Các ứng dụng sinh hóa
Nói chung, ESA được coi là sắc ký phân giải thấp vì nó không phân biệt loài rất giống tốt, và được Thường Do đó dành cho trận chung kết “đánh bóng” bước của thanh lọc. Kỹ thuật có thể xác định cấu trúc bậc bốn của tinh khiết trao đổi protein que có thời gian chậm, vì nó có thể được thực hiện dưới điều kiện giải pháp tự nhiên, giữ gìn tương tác phân tử. SEC Assay thể Cũng protein cấu trúc đại học, vì nó đo lường khối lượng thủy động lực (trọng lượng phân tử không) Cho phép gập và mở ra các phiên bản của protein tương tự được phân biệt. Ví dụ, bán kính thủy động lực rõ ràng của một miền protein điển hình có thể là 14 Å và 36 Å cho các dạng gấp và không gấp. SEC cho phép tách hai dạng này, vì dạng gấp rút thay đổi nhiều lần do kích thước nhỏ hơn của nó.
Tổng hợp Polymer
SEC có thể được sử dụng như một thước đo của cả kích thước và polydispersity của một polyme tổng hợp, đó là, khả năng tìm thấy sự phân bố của các kích cỡ của các phân tử polymer. Một đường chuẩn chuẩn có thể được sử dụng để xác định kích cỡ các phân tử polymer quan tâm trong dung môi được lựa chọn để phân tích (thường THF). Theo cách khác, các kỹ thuật như tán xạ ánh sáng và / hoặc viscometry có thể được sử dụng trực tuyến với SEC để tạo ra trọng lượng phân tử tuyệt đối mà không dựa vào hiệu chuẩn với các tiêu chuẩn xác định trọng lượng phân tử. Do sự khác nhau về kích thước của hai polyme với trọng lượng phân tử giống hệt nhau, nên các phương pháp xác định tuyệt đối nói chung là đáng mong muốn hơn. Một hệ thống SEC điển hình có thể nhanh chóng (trong khoảng nửa giờ) cung cấp cho các nhà hóa học polymer các thông tin về kích thước và sự đa dạng của mẫu. Các SEC chuẩn bị có thể được sử dụng cho phân đoạn polymer trên một quy mô phân tích.