Các xét nghiệm axit bicinchoninic (xét nghiệm BCA), còn được gọi là khảo nghiệm Smith, sau khi nhà phát minh Paul K. Smith tại Pierce Chemical Company, là một bài kiểm định sinh hóa để xác định tổng nồng độ protein trong dung dịch (0.5 μg / mL đến 1,5 mg / mL), tương tự như xét nghiệm protein Lowry, thử nghiệm protein Bradford hoặc chất thử biuret. Nồng độ protein tổng thể được biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của dung dịch mẫu từ xanh sang tím tương ứng với nồng độ protein, sau đó có thể được đo bằng các kỹ thuật màu.
Cơ chế
Một giải pháp BCA cổ phiếu chứa các thành phần sau đây trong một dung dịch có tính kiềm cao với độ pH 11,25:
- Axit bicinchoninic
- Sô đa
- Natri bicarbonate
- Natri tartrate
- Đồng pentahydrat sulfat đồng (II)
- Các xét nghiệm BCA chủ yếu dựa vào hai phản ứng.
Thứ nhất, liên kết peptide trong protein làm giảm ion Cu2 + từ sulfat đồng (II) thành Cu + (một phản ứng phụ thuộc nhiệt độ). Lượng Cu2 + giảm tương ứng với lượng protein có trong dung dịch. Tiếp theo, hai phân tử của axit bicinchoninic chelate với mỗi ion Cu +, tạo thành một phức hợp màu tím hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 562 nm.
Các phức hợp bicinchoninic acid Cu + bị ảnh hưởng trong các mẫu protein do sự hiện diện của cysteine / cystine, tyrosine, và các chuỗi phụ tryptophan. Ở nhiệt độ cao hơn (37 đến 60 ° C), các liên kết peptit hỗ trợ cho sự hình thành phức hợp phản ứng. Ủ các xét nghiệm BCA ở nhiệt độ cao hơn được khuyến cáo như là một cách để tăng độ nhạy trong khi khảo sát đồng thời giảm thiểu sự khác biệt do thành phần acid amin không đồng đều.
Số lượng protein có trong dung dịch có thể được định lượng bằng cách đo phổ hấp thụ và so sánh với các dung dịch protein có nồng độ đã biết.