Điện di gel – Phần 3

Điều kiện gel
Denaturing

Các thông số TTGE thể hiện sự đa dạng bifidobacterial của các mẫu phân từ hai tình nguyện viên khỏe mạnh (A và B) trước và sau khi điều trị AMC (uống amoxicillin-clavulanic)
Chất denaturing được chạy theo các điều kiện phá vỡ cấu trúc tự nhiên của chất phân tích, khiến nó trở thành một chuỗi tuyến tính. Do đó, sự di động của mỗi đại phân tử chỉ phụ thuộc vào chiều dài tuyến tính và tỷ số khối lượng của nó-to-charge. Do đó, cấp bậc thứ cấp, bậc ba và bậc bốn của cấu trúc phân tử sinh học bị phá vỡ, chỉ để lại cấu trúc chính.

Các axit nucleic thường bị biến tính bằng cách đưa urê vào trong đệm, trong khi các protein được làm biến tính bằng natri dodecyl sulfate, thường là một phần của quá trình SDS-PAGE. Đối với sự thoái hoá protein hoàn toàn, cần phải giảm các liên kết disulfide cộng hóa trị để ổn định cấu trúc bậc ba và bậc bốn, gọi là phương pháp giảm PAGE. Các điều kiện giảm thường được duy trì bằng cách bổ sung beta-mercaptoethanol hoặc dithiothreitol. Để phân tích chung các mẫu protein, làm giảm PAGE là dạng phổ biến nhất của điện di protein.

Điều kiện denatu là cần thiết để ước tính đúng về trọng lượng phân tử của RNA. RNA có thể tạo ra sự tương tác nội bào hơn DNA có thể dẫn đến thay đổi tính di động của nó. Urê, DMSO và glyoxal là các chất gây nên thường được sử dụng nhất để phá vỡ cấu trúc RNA. Ban đầu, methylmercury hydroxide độc ​​tính cao thường được sử dụng trong quá trình điện di RNA gây biến tính,  nhưng nó có thể là phương pháp được lựa chọn cho một số mẫu 

Quá trình điện di gel đảo ngược được sử dụng trong phương pháp dựa trên các mô hình dựa trên các mẫu DNA và RNA gradien hóa nhiệt độ gel (TGGE) và điện di gel điện phân gradient (DGGE). 

Bản địa 

Sự nhuộm liên kết enzym cụ thể: isoenzymes glucose-6-phosphate Dehydrogenase trong hồng cầu nhiễm Plasmodium falciparum 
Các mỡ tự nhiên được vận hành trong các điều kiện không gây biến dưỡng, để cấu trúc tự nhiên của chất phân tích được duy trì. Điều này cho phép kích thước vật lý của phức hợp gấp hoặc phức hợp ảnh hưởng đến tính di động, cho phép phân tích cả bốn cấp của cấu trúc phân tử. Đối với các mẫu sinh học, chất tẩy rửa chỉ được sử dụng trong phạm vi mà chúng cần thiết để lyse màng lipid trong tế bào. Các phức hợp vẫn còn – đối với hầu hết các phần liên quan và gấp lại như chúng sẽ có trong tế bào. Tuy nhiên, một nhược điểm là phức hợp có thể không tách rời rõ ràng hoặc có thể dự đoán, vì rất khó để dự đoán hình dạng và kích thước của phân tử sẽ ảnh hưởng đến tính di động của nó như thế nào. Giải quyết và giải quyết vấn đề này là mục đích chính của PAGE định lượng.

Không giống như các phương pháp làm biến tính, điện di gel tự nhiên không sử dụng một tác nhân biến tính có điện tích. Các phân tử được tách ra (thường là các protein hoặc các axit nucleic) do đó không chỉ khác nhau về khối lượng phân tử và điện tích nội tại, mà còn là diện tích mặt cắt ngang, và do đó có các lực điện động khác nhau phụ thuộc vào hình dạng của cấu trúc tổng thể. Đối với protein, vì chúng tồn tại ở trạng thái bản địa nên chúng có thể được hình dung không chỉ bởi thuốc nhuộm nhuộm tổng hợp protein mà còn bởi sự nhuộm liên kết enzyme cụ thể.

Một ví dụ thí nghiệm cụ thể của một ứng dụng điện di gel tự nhiên là kiểm tra hoạt động enzym để xác minh sự hiện diện của enzyme trong mẫu trong quá trình tinh chế protein. Ví dụ, đối với protein alkaline phosphatase, dung dịch nhuộm là hỗn hợp của muối 4-chloro-2-2metylbenzenediazonium với 3-phospho-2-naphtoic acid-2′-4′-dimetyl anilin trong dung dịch Tris. Chất nhuộm này được bán thương mại dưới dạng kit cho chất nhuộm màu. Nếu protein có mặt, cơ chế phản ứng diễn ra theo thứ tự sau: nó bắt đầu với sự khử phosphoryl của axit 3-phospho-2-naphtoit-2′-4′-dimetyl anilin bằng alkaline phosphatase (nước cần thiết cho phản ứng). Nhóm phosphat được giải phóng và được thay thế bằng một nhóm rượu từ nước. Các electrophile 4 – chloro -2-2 methylbenzenediazonium (Fast Red TR Diazonium muối) thay thế các nhóm rượu tạo thành sản phẩm cuối cùng Red Azo thuốc nhuộm. Như tên của nó ngụ ý, đây là sản phẩm có thể nhìn thấy màu đỏ cuối cùng của phản ứng. Trong thí nghiệm đại học về thanh lọc protein, gel thường được chạy bên cạnh các mẫu tinh chế thương mại để hình dung ra các kết quả và gây nhầm lẫn về việc liệu việc tinh chế thành công hay không.

Điện di gel tự nhiên thường được sử dụng trong proteomics và metallomics. Tuy nhiên, PAGE gốc cũng được sử dụng để quét gen (DNA) cho những đột biến không rõ như trong đa hình cấu trúc đơn sợi.

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Scroll to Top