Di cư của axit nucleic trong gel agarose
Các yếu tố ảnh hưởng đến di cư của axit nucleic trong gel
Gel của các chế phẩm plasmid thường cho thấy một dải lớn của DNA siêu trùm với các dải khác mờ hơn trong cùng một làn đường. Lưu ý rằng theo quy ước gel DNA được hiển thị với các đoạn DNA nhỏ hơn gần dưới cùng của gel. Điều này là do lịch sử của các tinh thể DNA được chạy theo chiều dọc và các đoạn DNA nhỏ di chuyển xuống dưới nhanh hơn.
Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự di chuyển của axit nucleic: kích thước của gel lỗ chân lông (nồng độ gel), kích cỡ DNA được điện di hoá, điện áp sử dụng, sức mạnh ion của đệm và nồng độ thuốc nhuộm intercalating như ethidium bromide nếu được sử dụng trong quá trình điện di.
Các phân tử nhỏ đi nhanh hơn các phân tử lớn hơn trong gel, và ADN kép sẽ di chuyển với tỷ lệ nghịch với log10 của số cặp base. Mối quan hệ này vỡ ra với các đoạn DNA rất lớn, và việc phân tách các đoạn DNA rất lớn đòi hỏi phải sử dụng điện di gel trường xung (pulsed field gel electrophoresis – PFGE).
Đối với điện di gel agarose chuẩn, các phân tử lớn sẽ được giải quyết tốt hơn bằng cách sử dụng gel có nồng độ thấp trong khi các phân tử nhỏ lại tách riêng tốt hơn với gel có nồng độ cao. Nồng độ cao gel tuy nhiên đòi hỏi thời gian chạy dài hơn (đôi khi ngày).
Sự di chuyển của DNA có thể bị ảnh hưởng bởi sự hình thành của phân tử DNA, ví dụ DNA siêu tráng thường di chuyển nhanh hơn DNA đã được thư giãn bởi vì nó được cuộn chặt chẽ và do đó nhỏ hơn. Trong một sự chuẩn bị DNA plasmid bình thường, có thể có nhiều dạng của DNA. Điện di gel của plasmid thường sẽ cho thấy hình dạng phủ siêu âm như dải chính, trong khi DNA bị nứt (dạng hình tròn mở) và dạng hình tròn đóng nắp thoải mái xuất hiện dưới dạng các dải nhỏ. Tuy nhiên tốc độ di chuyển của các dạng khác nhau có thể thay đổi bằng các điều kiện điện di động khác nhau , và sự di chuyển của ADN tròn lớn có thể bị ảnh hưởng mạnh hơn DNA tuyến tính do kích thước lỗ chân lông của gel .
Ethidium bromide có thể can thiệp vào DNA tròn có thể thay đổi điện tích, chiều dài, cũng như độ siêu dẫn của phân tử DNA, do đó sự có mặt của nó trong gel trong quá trình điện di động có thể ảnh hưởng đến chuyển động của nó. Agarose gel electrophoresis có thể được sử dụng để giải quyết DNA tròn với topo supercoiling khác nhau
Tổn thất DNA do sự liên kết chéo tăng lên cũng sẽ làm giảm quá trình di chuyển DNA điện di động theo một cách phụ thuộc liều .
Tỷ lệ di cư của DNA là tỷ lệ với điện áp được áp dụng, nghĩa là điện thế càng cao, thì DNA càng nhanh. Độ phân giải của các đoạn DNA lớn tuy nhiên thấp hơn ở điện áp cao. Sự chuyển động của ADN cũng có thể thay đổi trong một trường không ổn định – trong một lĩnh vực được đảo ngược theo định kỳ, tính di động của DNA có kích thước đặc biệt có thể giảm đáng kể ở một tần số đi xe đạp cụ thể. Hiện tượng này có thể dẫn đến sự đảo ngược dải trong quá trình điện di gel đảo ngược trường (FIGE), nhờ đó các đoạn ADN lớn hơn di chuyển nhanh hơn các đoạn DNA nhỏ hơn.
Di chuyển bất thường
Gel “Smiley” – hiệu ứng cạnh này được gây ra khi điện áp được áp dụng quá cao để sử dụng nồng độ gel
Quá tải DNA – quá tải DNA làm chậm sự di chuyển của các đoạn DNA.
Sự nhiễm bẩn – sự hiện diện của tạp chất, như muối hoặc protein có thể ảnh hưởng đến chuyển động của DNA.
Cơ chế di chuyển và chia tách
Điện tích âm của xương phosphate của nó di chuyển DNA tới cực dương tích điện dương trong quá trình điện di. Tuy nhiên, di chuyển các phân tử DNA trong dung dịch, khi không có ma trận gel, độc lập với trọng lượng phân tử trong quá trình điện di. Ma trận gel do đó có trách nhiệm tách DNA theo kích thước trong quá trình điện di, và một số mô hình tồn tại để giải thích cơ chế tách các phân tử sinh học trong ma trận gel. Một mô hình được chấp nhận rộng rãi là mô hình Ogston xử lý ma trận polymer như một cái sàng. Một protein hình cầu hoặc một ADN cuộn cảm ngẫu nhiên di chuyển qua các lỗ nối liền nhau, và sự di chuyển của các phân tử lớn hơn có thể bị cản trở và làm chậm lại do va chạm với ma trận gel, và các phân tử có kích cỡ khác nhau có thể được tách ra trong quá trình sàng .
Mô hình Ogston phân chia cho các phân tử lớn nhờ đó các lỗ nhỏ hơn đáng kể so với kích thước của phân tử. Đối với các phân tử DNA có kích thước lớn hơn 1 kb, một mô hình reptation (hoặc các biến thể của nó) được sử dụng phổ biến nhất. Mô hình này giả định rằng DNA có thể thu thập dữ liệu theo kiểu “giống rắn” (vì thế “ăn năn”) thông qua các lỗ chân lông như một phân tử dài. Một mô hình reptation thiên vị áp dụng ở cường độ điện trường cao hơn, theo đó đầu cuối của phân tử trở nên mạnh mẽ theo hướng về phía trước và kéo phần còn lại của phân tử dọc theo. Tuy nhiên, kính hiển vi huỳnh quang thời gian thực của các phân tử bị nhuộm cho thấy các động lực tinh tế hơn trong quá trình điện di, với DNA thể hiện tính đàn hồi đáng kể khi nó luân phiên trải dài theo hướng của trường ứng dụng và sau đó co lại thành một quả bóng, hoặc bị móc nối thành hình chữ U khi nó bị bắt trên các sợi polymer.