A260 như Số lượng Đo lường
Các “đơn vị A260” được sử dụng như một biện pháp số lượng cho axit nucleic. Một đơn vị A260 là lượng axit nucleic chứa trong 1 mL và tạo ra OD của 1. Các yếu tố chuyển đổi giống nhau được áp dụng, và do đó, trong những bối cảnh như vậy:
1 đơn vị A260 dsDNA = 50 μg
1 đơn vị A260 ssDNA = 33 μg
1 đơn vị A260 ssRNA = 40 μg
Độ tinh khiết mẫu (260: 280/260: 230 Ratios)
Thông thường các mẫu axit nucleic bị ô nhiễm các phân tử khác (tức là các protein, các hợp chất hữu cơ, và các chất khác). Lợi ích thứ hai của việc sử dụng phân tích quang phổ để xác định lượng axit nucleic là khả năng xác định độ tinh khiết mẫu sử dụng tính toán 260 nm: 280 nm. Tỷ lệ hấp thụ ở 260 và 280 nm (A260 / 280) được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của axit nucleic. Đối với ADN tinh khiết, A260 / 280 được coi là rộng rãi ~ 1,8 nhưng đã được lý luận để dịch – do lỗi số trong bài báo Warburg ban đầu – thành một hỗn hợp gồm 60% protein và 40% DNA. Tỷ lệ của RNA tinh khiết A260 / 280 là ~ 2,0. Các tỉ lệ này thường được sử dụng để đánh giá lượng ô nhiễm protein còn lại từ quá trình cô lập axit nucleic do các protein hấp thụ ở 280 nm.
Tỷ lệ hấp thụ ở 260 nm so với 280 nm thường được sử dụng để đánh giá sự ô nhiễm DNA của các giải pháp protein vì các protein (đặc biệt là axit amin thơm) hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 280 nm. Ngược lại, tuy nhiên, không đúng – phải mất một lượng tương đối lớn chất ô nhiễm protein để có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ 260: 280 trong dung dịch axit nucleic.
Tỷ lệ 260: 280 có độ nhạy cao đối với sự nhiễm bẩn axit nucleic trong protein:
| % protein | % nucleic acid | 260:280 ratio |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 0.57 |
| 95 | 5 | 1.06 |
| 90 | 10 | 1.32 |
| 70 | 30 | 1.73 |
260:230 ratio lacks sensitivity for protein contamination in nucleic acids (table shown for RNA, 100% DNA is approximately 1.8):
| % nucleic acid | % protein | 260:230 ratio |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 2.00 |
| 95 | 5 | 1.99 |
| 90 | 10 | 1.98 |
| 70 | 30 | 1.94 |
Sự khác biệt này là do các axit nucleic có hệ số suy giảm lớn hơn nhiều ở 260 nm và 280 nm, so với các protein. Do đó, ngay cả đối với nồng độ protein tương đối cao, protein đóng góp rất ít so với hấp thụ 260 và 280. Mặc dù không thể đánh giá được sự ô nhiễm protein một cách đáng tin cậy với tỉ lệ 260: 280, điều này cũng có nghĩa là nó góp phần ít nhầm để ước lượng số lượng DNA.
Xác định nhiễm bẩn
Việc kiểm tra phổ mẫu có thể hữu ích trong việc xác định một vấn đề với độ tinh khiết mẫu tồn tại.
| Low Reading | High Reading | |
|---|---|---|
| A260/A230 Ratio |
|
|
| A260/A280 Ratio |
|
* High 260/280 purity ratios are not normally indicative of any issues. |
Các chất ô nhiễm thông thường khác
Sự nhiễm bẩn bởi phenol, thường được sử dụng trong quá trình lọc axit nucleic, có thể làm giảm đáng kể các ước tính lượng tử. Phenol hấp thụ với đỉnh ở 270 nm và A260 / 280 là 1.2. Các chế phẩm acid nucleic không bị ô nhiễm bởi phenol nên có A260 / 280 khoảng 2. Sự nhiễm bẩn bởi phenol có thể góp phần đáng kể vào việc đánh giá quá cao nồng độ DNA.
Hấp thụ ở 230 nm có thể là do ô nhiễm bởi ion phenolate, thiocyanat và các hợp chất hữu cơ khác. Đối với mẫu RNA tinh khiết, A230: 260: 280 phải là khoảng 1: 2: 1, và đối với một mẫu DNA tinh khiết, A230: 260: 280 phải là khoảng 1: 1,8: 1.
Hấp thụ ở 330 nm và cao hơn cho thấy các hạt bụi gây ô nhiễm dung dịch, gây ra sự tán xạ của ánh sáng trong phạm vi khả kiến. Giá trị trong một mẫu axit nucleic tinh khiết phải bằng 0.
Các giá trị âm có thể xảy ra nếu một giải pháp không chính xác đã được sử dụng như trống. Ngoài ra, các giá trị này có thể phát sinh do sự huỳnh quang của thuốc nhuộm trong dung dịch.
Phân tích với thuốc nhuộm huỳnh quang (Fluorescent Dye Tagging)
Một phương pháp thay thế để đánh giá nồng độ DNA và RNA là gắn nhãn mẫu với một thẻ huỳnh quang, một loại thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để đo cường độ của thuốc nhuộm kết hợp với axit nucleic và sự huỳnh quang chọn lọc khi bị ràng buộc (ví dụ như Ethidium bromide). Phương pháp này rất hữu ích trong những trường hợp nồng độ quá thấp để đánh giá chính xác bằng phương pháp quang phổ và trong trường hợp các chất gây ô nhiễm hấp thụ ở bước sóng 260 nm làm cho việc định lượng chính xác theo phương pháp đó là không thể. Lợi ích của việc định lượng huỳnh quang của DNA và RNA là độ nhạy cao hơn so với phân tích quang phổ. Mặc dù, sự gia tăng độ nhạy cảm đi kèm với chi phí của một mức giá cao hơn cho mỗi mẫu và quá trình chuẩn bị mẫu dài hơn.
Có hai cách chính để tiếp cận vấn đề này. “Đốm” bao gồm việc đặt mẫu trực tiếp lên gel agarose hoặc plastic bọc. Thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc là có trong gel agarose, hoặc được thêm vào trong các nồng độ thích hợp cho các mẫu trên màng nhựa. Một tập hợp các mẫu với nồng độ đã biết được phát hiện cùng với mẫu. Nồng độ của mẫu không rõ được ước tính bằng cách so sánh với huỳnh quang của các nồng độ đã biết này. Ngoài ra, người ta có thể chạy mẫu qua một gel agarose hoặc polyacrylamide, cùng với một số mẫu có nồng độ đã biết. Giống như kiểm tra tại chỗ, nồng độ được ước lượng thông qua so sánh cường độ huỳnh quang với các mẫu đã biết.
Nếu khối lượng mẫu đủ lớn để sử dụng micro hoặc cuvettes, các mẫu thuốc nhuộm có thể được định lượng bằng quang kế huỳnh quang. Thể tích mẫu tối thiểu bắt đầu ở 0.3 μl
Cho đến nay không có phương pháp huỳnh quang để xác định ô nhiễm protein của một mẫu DNA tương tự phiên bản phổ phổ 260 nm / 280 nm