Thông thường, sắc ký cột được thiết lập với máy bơm nhu động, bộ đệm chảy và dung dịch mẫu qua đỉnh của cột. Các giải pháp và bộ đệm đi qua cột, nơi một bộ phận phân tích ở phần cuối của thiết lập cột thu thập các mẫu lấy tẩy. Trước khi thu thập các phần, các mẫu được tách ra từ cột đi qua một máy dò như một máy quang phổ hoặc quang phổ khối để có thể xác định được nồng độ các mẫu tách ra trong hỗn hợp mẫu.
Ví dụ, nếu bạn tách hai loại protein khác nhau với khả năng liên kết khác nhau đến cột từ một dung dịch mẫu, một loại máy dò tốt sẽ là một quang phổ kế sử dụng bước sóng 280 nm. Nồng độ protein đi qua dung dịch rửa qua cột càng cao, thì độ hấp thụ của bước sóng đó càng cao.
Do sắc ký cột có dòng chảy không đổi của dung dịch rửa qua bộ dò ở các nồng độ khác nhau nên máy dò phải vẽ nồng độ của mẫu đã rửa trong một khoảng thời gian. Biểu đồ nồng độ mẫu so với thời gian được gọi là sắc ký đồ.
Mục đích cuối cùng của sắc ký là tách các thành phần khác nhau ra khỏi hỗn hợp dung dịch. Nghị quyết thể hiện mức độ tách biệt giữa các thành phần từ hỗn hợp. Độ phân giải của sắc ký càng lớn thì mức phân tách của các mẫu càng lớn. Dữ liệu này là một cách hay để xác định thuộc tính của cột của mẫu cụ thể đó. Độ phân giải có thể được tính từ sắc ký đồ.
Các đường cong riêng biệt trong sơ đồ thể hiện các hồ sơ nồng độ lấy mẫu khác nhau theo thời gian dựa trên ái lực của chúng đối với nhựa cột. Để tính độ phân giải, cần phải có thời gian lưu và chiều rộng đường cong.
Thời gian lưu giữ: Là thời điểm bắt đầu phát hiện tín hiệu của máy dò tới chiều cao đỉnh của hồ chứa tập trung của mỗi mẫu khác nhau.
Chiều rộng đường cong: Chiều rộng của đường cong nồng độ của các mẫu khác nhau trên sắc ký đồ của các đơn vị thời gian.
Một phương pháp đơn giản để tính độ phân giải của sắc ký đồ là sử dụng mô hình tấm [6]. Các mô hình tấm giả định rằng cột có thể được chia thành số lượng nhất định của các phần, hoặc tấm và cân bằng khối lượng có thể được tính cho mỗi tấm riêng lẻ. Phương pháp này xấp xỉ một đường cong sắc ký chuẩn như là một đường phân phối Gaussian. Bằng cách này, chiều rộng đường cong được ước tính là 4 lần độ lệch chuẩn của đường cong, 4σ. Thời gian lưu giữ là thời gian kể từ khi bắt đầu phát hiện tín hiệu đến thời điểm chiều cao đỉnh của đường cong Gaussian.
Từ các biến trong hình trên, độ phân giải, số tấm, chiều cao tấm của mô hình tấm cột có thể được tính bằng các phương trình:
Resolution (Rs)
Rs = 2(tRB – tRA)/(wB + wA)
Where:
tRB = retention time of solute B
tRA = retention time of solute A
wB = Gaussian curve width of solute B
wA = Gaussian curve width of solute A
Plate Number (N):
N = (tR)2/(w/4)2
Plate Height (H):
H = L/N
Where L is the length of the column