Phép thử điện di Gel Tế bào Đơn (SCGE, còn được gọi là khảo sát sao chổi) là một kỹ thuật không biến chứng và nhạy cảm để phát hiện sự hư hại DNA ở mức độ của tế bào eukaryote riêng lẻ. Nó lần đầu tiên được phát triển bởi Östling & Johansson vào năm 1984 và sau đó được sửa đổi bởi Singh et al. vào năm 1988. Từ đó nó đã trở nên phổ biến như là một kỹ thuật chuẩn để đánh giá sự phá huỷ DNA / sửa chữa, kiểm tra sinh học và kiểm tra độc tính gen. Nó bao gồm việc đóng gói các tế bào trong hệ thống treo agaroza tan chảy, tách các tế bào trong điều kiện trung hòa hoặc kiềm (pH> 13), và điện di của các tế bào lys lơ lửng. Thuật ngữ “sao chổi” dùng để chỉ mô hình di cư DNA qua gel điện di, thường giống với sao chổi
Các xét nghiệm sao chổi (điện di gel tế bào đơn) là một phương pháp đơn giản để đo phá vỡ sợi thần kinh deoxyribonucleic (DNA) trong tế bào nhân chuẩn. Các tế bào được nhúng trong agarose trên kính hiển vi hiển vi được lysed với chất tẩy rửa và muối cao để tạo thành các nucleoids có chứa các vòng siêu siêu của DNA liên kết với ma trận hạt nhân. Điện di ở độ pH cao kết quả trong các cấu trúc giống như sao chổi, được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang; cường độ của đuôi sao chổi so với đầu phản ánh số lượng DNA bị phá vỡ. Cơ sở có thể cho điều này là các vòng có chứa một sự phá vỡ mất supercoiling của họ và trở nên tự do để mở rộng về phía cực dương. Tiếp theo là phân tích hình ảnh với nhuộm DNA và tính huỳnh quang để xác định mức độ tổn thương DNA. Điều này có thể được thực hiện bằng cách chấm điểm thủ công hoặc tự động bằng phần mềm hình ảnh
Đóng gói
Một mẫu tế bào, hoặc được lấy từ nuôi cấy in vitro hoặc từ một vật thí nghiệm in vivo được phân tán thành các tế bào riêng lẻ và được lơ lửng ở agarose tan chảy ở nhiệt độ 37 ° C. Hệ thống mono-suspension này được đúc bằng kính hiển vi. Một tấm che kính được giữ ở một góc và hệ thống treo đơn áp dụng cho các điểm tiếp xúc giữa lớp phủ che phủ và miếng trượt. Khi lớp phủ ngoài được hạ xuống trên tấm trượt, agarose nóng chảy lan ra để tạo thành một lớp mỏng. Các agarose là gel tại 4 ° C và các coverslip gỡ bỏ.
Các agarose tạo thành một ma trận các sợi carbohydrate mà gói gọn các tế bào, neo chúng tại chỗ. Agarose được xem là trung tính thẩm thấu, do đó các dung dịch có thể xâm nhập vào gel và ảnh hưởng đến các tế bào không có vị trí chuyển vị của tế bào.
Trong một nghiên cứu in vitro các tế bào sẽ được tiếp xúc với một tác nhân xét nghiệm – thường là tia cực tím, phóng xạ ion hoá, hoặc một chất độc genotoxic – để gây ra tổn thương DNA trong các tế bào đóng gói. Đối với việc hiệu chuẩn, hydrogen peroxide thường được sử dụng để cung cấp mức độ tổn thương DNA chuẩn.
Lysis
Các slide này sau đó được đắm mình trong một dung dịch làm cho tế bào tan chảy. Giải pháp ly giải thường được sử dụng trong thí nghiệm sao chổi bao gồm muối nước có độ cô đặc cao (thường dùng muối ăn phổ biến) và chất tẩy rửa (Triton X-100 hoặc sarcosinate). Độ pH của dung dịch ly giải có thể được điều chỉnh (thường giữa pH trung tính và kiềm) phụ thuộc vào loại thiệt hại mà nhà nghiên cứu đang điều tra.
Muối trong nước làm gián đoạn protein và các mô liên kết của chúng trong tế bào cũng như phá vỡ nội dung RNA của tế bào. Chất tẩy sẽ giải thể các màng tế bào. Thông qua hoạt động của dung dịch tách, các tế bào sẽ bị phá hủy. Tất cả các protein, RNA, màng tế bào và các thành phần tế bào chất và hạt nhân bị phá vỡ và khuếch tán vào ma trận agarose. Chỉ có DNA của tế bào vẫn còn, và làm sáng tỏ để lấp đầy khoang trong agarose mà toàn bộ tế bào trước đây được làm đầy. Cấu trúc này được gọi là nucleoid (một thuật ngữ chung cho một cấu trúc trong đó DNA được tập trung).
Điện di
Sau khi tách các tế bào (điển hình là từ 1 đến 2 giờ ở 4 ° C), các slide được rửa trong nước cất để loại bỏ tất cả muối và ngâm trong dung dịch thứ hai – dung dịch điện giải. Một lần nữa giải pháp này có thể được điều chỉnh pH tùy thuộc vào loại thiệt hại đang được điều tra.
Các slide này được để lại cho ~ 20 phút trong dung dịch điện giải trước khi một điện trường được áp dụng. Trong điều kiện kiềm, xoắn kép DNA bị biến tính và hạt nhân trở thành một sợi đơn.
Một trường điện được áp dụng (điển hình là 1 V / cm) trong khoảng ~ 20 phút. Sau đó, các tấm phủ này được trung hòa đến pH 7, nhuộm màu với một vết loang huỳnh quang đặc hiệu DNA và được phân tích bằng kính hiển vi với CCD gắn liền (thiết bị kết hợp điện tích – chủ yếu là máy ảnh kỹ thuật số) được kết nối với máy tính có phần mềm phân tích hình ảnh.