Một marker kích thước trọng lượng phân tử, còn được gọi là bậc thang protein, bậc thang DNA hoặc thang RNA, là một bộ tiêu chuẩn được sử dụng để xác định kích cỡ gần đúng của một phân tử chạy trên gel trong quá trình điện di, sử dụng nguyên tắc phân tử trọng lượng tỷ lệ nghịch với tỷ lệ di cư thông qua một ma trận gel. Vì vậy, khi được sử dụng trong điện di gel, các dấu hiệu hiệu quả cung cấp một thang logarithmic để ước lượng kích cỡ của các mảnh khác (cung cấp các kích thước mảnh của marker được biết đến).
Các dấu hiệu protein, DNA, và RNA với các kích thước và nồng độ các đoạn được xác định trước sẵn có trên thị trường. Chúng có thể được chạy bằng agarose hoặc polyacrylamide gels. Các dấu hiệu được nạp vào các làn xe liền kề với làn đường mẫu trước khi bắt đầu chạy.
Các dấu hiệu DNA
Gel điện hóa với các dãy DNA có chiều dài khác nhau ở ngõ trái và làn đường giữa. Kích thước mảnh được đánh dấu ở bên phải, theo cặp base.
Phát triển
Mặc dù khái niệm dấu hiệu phân tử đã được giữ lại, các kỹ thuật phát triển đã thay đổi trong suốt nhiều năm. Những phát minh mới về các dấu phân tử phân tử được phân phối trong các bộ dụng cụ đặc biệt cho loại marker.
Một vấn đề ban đầu trong việc phát triển các điểm đánh dấu đã đạt được độ phân giải cao trong suốt chiều dài của điểm đánh dấu . Tùy thuộc vào điều kiện hoạt động của điện di gel, các mảnh vỡ có thể đã được nén, phá vỡ sự rõ ràng. Để giải quyết vấn đề này, một bộ phân tích của Southern Blot được phát triển vào năm 1990, cung cấp điểm đánh dấu đầu tiên để kết hợp DNA và DNA thăm dò. Kỹ thuật này đã lợi dụng khoảng cách logarithmic, và có thể được sử dụng để xác định các dải đích có độ dài 20.000 nucleotide.
Thiết kế
Có hai phương pháp phổ biến để xây dựng một marker kích thước phân tử DNA. Một trong những phương pháp này sử dụng kỹ thuật thắt một phần. Thử DNA là quá trình mà các đoạn ADN tuyến tính được kết nối với nhau thông qua các liên kết cộng hoá trị; cụ thể hơn, những liên kết này là trái phiếu phosphodiester. Tại đây, một mảnh ADN duplex 100bp được ligat một phần. Hậu quả của việc này là các dimer của 200bp, trimers của 300bp, tetramers của 400bp, pentamers của 500bp, vv sẽ hình thành. Ngoài ra, một phần dsdNA 100bp sẽ vẫn còn. Kết quả là một DNA “bậc thang” gồm những mảnh DNA của khối phân tử đã biết được tạo ra trên gel
Phương pháp thứ hai sử dụng các enzyme hạn chế và một chuỗi DNA được công nhận. DNA được tiêu hóa bởi một enzyme hạn chế đặc biệt, kết quả là những mảnh DNA có khối lượng phân tử khác nhau. Một trong những ưu điểm của phương pháp này là có thể dễ dàng tạo ra nhiều marker hơn bằng cách tiêu hóa nhiều hơn DNA đã biết. Mặt khác, kích thước của các mảnh DNA được dựa trên các trang web mà các enzyme hạn chế cắt giảm. Điều này làm cho việc kiểm soát kích thước của các mảnh vỡ trong các điểm đánh dấu trở nên khó khăn hơn
Gần đây hơn, một phương pháp khác để xây dựng marker kích thước phân tử DNA được các phòng thí nghiệm sử dụng. Chiến lược này liên quan đến việc sử dụng Polymerase Chain Reaction (PCR). Điều này đạt được một hoặc hai cách: 1) một đích DNA được khuếch đại cùng một lúc thông qua các bộ primer, hoặc 2) các mục tiêu DNA khác nhau được khuếch đại độc lập thông qua các mồi đặc hiệu.
Ảnh hưởng của điều kiện gel
Giống như các mẫu thực nghiệm, các điều kiện của gel có thể ảnh hưởng đến marker kích thước trọng lượng phân tử chạy dọc theo chúng. Các yếu tố như đệm, điện tích và nồng độ gel có thể ảnh hưởng đến tính di động và / hoặc sự xuất hiện của điểm đánh dấu / bậc thang / tiêu chuẩn của bạn. Các yếu tố này cần được xem xét khi lựa chọn một điểm đánh dấu và khi phân tích các kết quả cuối cùng trên gel.
Gel agarose 1.2% cho thấy hai bậc thang DNA khác nhau nhuộm với vết ố GelRed
Bộ đệm
Buffers hành động để 1) thiết lập độ pH, và 2) cung cấp ion để hỗ trợ tính dẫn. Trong quá trình điện di DNA, TAE (Tris-acetate-EDTA) và TBE (Tris-borate-EDTA) là các bộ đệm thông thường được lựa chọn. TBE đệm được ưu tiên cho các đoạn DNA nhỏ, trong khi TAE thích hợp hơn cho các mảnh lớn hơn 1500 cặp base. Về khả năng đệm, TAE thấp hơn so với TBE; điều này thường dẫn đến sự di chuyển chậm hơn của DNA. TBE cũng có khả năng giải quyết tốt hơn.
Cần lưu ý rằng nước không thể hoạt động như một chất thay thế cho một trong các bộ đệm, vì DNA sẽ không di chuyển dọc theo gel. Hơn nữa, sử dụng nước thay vì đệm sẽ dẫn đến sự tan chảy của gel
Phí / điện áp
Về điện áp, phạm vi được khuyến cáo là từ 4 đến 10 V / cm (tức là, volts / cm). Agarose gel thường chạy ở điện áp 5 V / cm. Cần lưu ý rằng đơn vị khoảng cách, cm, là khoảng cách giữa các điện cực (tức là cực dương và cực âm) chứ không phải chiều dài của gel.
Điện áp quá xa hoặc ở trên phạm vi này sẽ ảnh hưởng đến tính di động và độ phân giải của dải. Điện áp thấp sẽ làm giảm tính di động và sẽ làm cho các băng tần mở rộng. Mặt khác, điện áp cao