Sự tập trung
Nồng độ Agarose phải được tính đến khi lựa chọn một điểm đánh dấu. Tỷ lệ% gel ảnh hưởng đến sự di chuyển của DNA. Nói chung, nồng độ gel càng cao, tốc độ DNA sẽ di chuyển qua gel càng thấp. Đây là vai trò của trọng lượng phân tử trong di chuyển của một marker hoặc mẫu DNA, tức là, càng cao thì trọng lượng phân tử càng chậm thì DNA sẽ di chuyển chậm hơn
Nồng độ gel cũng ảnh hưởng đến khả năng hình dung ra các mảng bám trên gel. Các dải nhỏ hơn được giải quyết tốt hơn trên gel có tỷ lệ phần trăm cao hơn, trong khi các dải phân tử tăng lên dễ dàng được hình dung trên một tỷ lệ phần trăm thấp hơn gel.
Protein markers
Phát triển
Trước đây, các dấu hiệu protein đã được phát triển bằng cách sử dụng nhiều loại protein khác nhau. Dấu hiệu protein bao gồm 49 chuỗi amino acid khác nhau, bao gồm các protein đa cực, và cho phép phân tích các protein phân cắt ở các vị trí khác nhau
Những cải tiến kỹ thuật hiện nay trong các dấu hiệu protein liên quan đến việc sử dụng tự động phát triển. Dấu hiệu protein đầu tiên được phát triển tự động đầu tiên được phát minh vào năm 2012.
Thiết kế
Tương tự như các marker DNA, các dấu hiệu này thường gồm các protein tinh chế có khối lượng phân tử đã được biết đến. Danh sách dưới đây phác thảo một số protein, cũng như khối lượng phân tử, thường được sử dụng khi xây dựng một điểm đánh dấu protein.
| Protein | Molecular Mass (kDa) |
| Beta-galactosidase | 120 |
| Phosphorylase B | 94 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | 67 |
| Ovalbumin | 43 |
| Turkey Albumin | 40 |
| Carbonic Anhydrase | 30 |
| Soybean Trypsin Inhibitor | 20.1 |
| a-Lactalbumin | 14.4 |
| Lysozyme | 14 |
Chọn marker chính xác protein
Dấu hiệu kích thước phân tử có thể được chia thành hai loại: điểm đánh dấu trọng số phân tử so với điểm đánh số bậc thang phân tử Các điểm đánh dấu được nhuộm hoặc không có vết bẩn, và tùy thuộc vào hoàn cảnh, người ta có thể thích hợp hơn với các điểm khác. Dấu phân số kích thước phân tử cũng có thể bị thay đổi về sinh hóa . Sự liên hợp với biotin là phổ biến nhất. Dấu hiệu kích thước phân tử trọng lượng thường được sử dụng trong điện di gel electrophoresis của SDS và polyacrylamide và phương pháp thấm nước ở phương tây. Với tất cả các loại khác nhau và sử dụng các dấu hiệu kích thước phân tử, điều quan trọng là chọn tiêu chuẩn protein phù hợp. Ngoài việc sử dụng phổ biến nhất, như là một cách để tính toán trọng lượng phân tử của các mẫu, các cách sử dụng khác bao gồm cho phép bằng chứng trực quan về sự di chuyển protein và hiệu quả chuyển giao và đôi khi thậm chí còn được sử dụng để kiểm soát tích cực
MW vs Protein thang
Dấu hiệu trọng lượng phân tử là một loại tiêu chuẩn protein. Chúng có thể được dồn lại hoặc không dính lại trước khi bốc hàng; tùy thuộc vào loại thử nghiệm có thể là một lợi thế hơn. Trong cả hai trường hợp, chúng thường chạy trên lane bên ngoài của gel, trong khi mẫu được nạp vào các làn đường giữa Các marker phân tử khác với các thang protein trong đó chúng bao gồm một hỗn hợp các protein bản địa có các đặc điểm kỹ thuật được phân loại tốt nhưng không tương ứng với số nguyên. Nói chung, chúng rẻ hơn nhiều, nhưng phân tích chỉ cho phép một giá trị xấp xỉ của điện phân tách protein.
Một bậc thang protein là một loại khác của tiêu chuẩn protein. Chúng gần như luôn luôn bị nhuộm màu. Các bậc thang protein khác với các marker phân tử trong đó chúng bao gồm một hỗn hợp các protein tinh khiết cao mà các thông số kỹ thuật của chúng được biết và tương ứng với các số nguyên tố . Nói chung các bậc thang protein bao gồm 10-12 protein. Vào cuối thí nghiệm, sau khi kích thước di chuyển xảy ra, một dải đơn sẽ đại diện cho kích thước của mỗi protein chứa trong bậc thang. Dấu hiệu được chia đều nhau, và phân tích kích thước bằng cách sử dụng những điểm đánh dấu cho phép một giá trị chính xác của protein quan tâm. Trong một số trường hợp, như là một phương pháp xác nhận phân tử, các dấu hiệu MW được chạy với các thang protein để xác minh.
Nhãn hiệu bền vững và không bị đóng băng
Dấu hiệu protein có thể trở nên không có vết lõm hoặc có dấu hiệu, nhưng cả hai đều có những lợi ích và bất lợi của nó . Hình ảnh đơn giản về tách và chuyển protein được thực hiện thông qua việc sử dụng các dấu hiệu đã được đánh dấu . Chúng thường được sử dụng trong cả điện di gel SDS-polyacrylamide và thấm nước ở phía tây. Trong SDS-PAGE nó cho phép theo dõi quá trình di chuyển protein, vì các dải protein sẽ tách ra và có thể được nhìn thấy trong quá trình chạy điện. Ở các blots phía tây, các tiêu chuẩn protein nhuộm cho phép chuyển đổi protein hình ảnh lên màng . Tuy nhiên, các quyết định về kích cỡ không chính xác với những điểm đánh dấu này (xem phần Kết hợp lại và Tự nhiên để giải thích thêm)
Trong khi các dấu hiệu không có vết bẩn cho phép xác định kích thước chính xác hơn, chúng không thể được xem trong khi gel đang chạy. Như vậy, gel phải được nhuộm màu để hình dung các dải
Nhãn tái tổ hợp và tự nhiên
Bên cạnh các dấu hiệu bị vấy bẩn và không có vết bẩn, các dấu hiệu protein có thể được nghĩ đến dưới dạng tái tổ hợp và tự nhiên . Dấu hiệu tái tổ hợp bao gồm các protein tái tổ hợp đã được tinh chế rất nhiều. Những điểm đánh dấu này được thiết kế sao cho làm nổi bật những đặc điểm riêng biệt . Ví dụ về các đặc tính này bao gồm các thẻ mối quan hệ và trọng lượng phân tử được thống nhất định vị tương đối so với nhau.
Các marker tự nhiên, như tên của nó, là một hỗn hợp các protein xảy ra tự nhiên . Dấu hiệu tự nhiên được đánh dấu hiệu quả hoạt động tốt cho hình ảnh tách gel. Tuy nhiên, các dấu hiệu này có xu hướng gắn kết với vết bẩn theo cách đồng hóa trị với các lượng khác nhau và ở các vị trí khác nhau Do đó, các dải kết quả có thể rộng hơn. Điều này đặc biệt đúng khi so sánh với các dấu hiệu tái tổ hợp được nâng cấp. Do tác động này, việc xác định trọng lượng phân tử có thể ít chính xác hơn với các dấu hiệu tự nhiên đã được đánh dấu .
Thay đổi về mặt sinh lý
Các tiêu chuẩn protein cũng có thể bị thay đổi về mặt hoá học. Một sự thay đổi thông thường là thông qua biotin sử dụng. Biotin có ái lực rất cao đối với streptavidin, và do đó, sự kết hợp tạo thành một phức hợp rất mạnh. Đối với visualization, một tag màu gắn với streptavidin.