Ảnh hưởng của điều kiện gel
Như với điện di DNA, các điều kiện như bộ đệm, điện tích / điện áp, và nồng độ nên được tính đến khi lựa chọn một điểm đánh dấu protein.
Bộ đệm
Bộ đệm có thể ảnh hưởng đến tính di động của cả điểm đánh dấu và các mẫu. Độ pH của đệm khác nhau với hệ thống được sử dụng và do đó, mỗi hệ thống đệm sẽ có một ảnh hưởng khác nhau của việc tích điện của một protein hoặc protein Ngoài ra, trong trường hợp của SDS-PAGE, ái lực liên kết đối với SDS có thể bị ảnh hưởng bởi hệ thống đệm . Ngay cả khi sử dụng cùng tỷ lệ phần trăm và loại gel, các protein tương tự sẽ di chuyển với các tốc độ khác nhau tùy thuộc vào chất đệm được sử dụng.
Phí / điện áp
Điện áp đóng một vai trò trong sự di chuyển của các protein trên gel. Protein sẽ di chuyển nhanh hơn ở điện áp cao hơn. Do đó, thời gian chạy gel sẽ ngắn hơn. Ngược lại, điện áp cao hơn có thể dẫn đến sự khuếch tán băng tần lớn hơn. Ngoài ra, nếu điện áp quá cao, nhiệt độ trong khoang điện di có thể trở nên như vậy mà gel bắt đầu tan chảy.
Điện áp mà một gel nên được chạy ở phụ thuộc vào loại gel. Đối với một số gel, điện áp vẫn không đổi trong suốt quá trình chạy, trong khi với các gel khác, điện áp ban đầu được cho phép không đổi trong một khoảng thời gian nhất định trước khi tăng lên. Điện áp thứ hai này sau đó được sử dụng cho một khung thời gian cụ thể, sau đó, nó cũng có thể được tăng lên.
Sự tập trung
Về tỷ lệ phần trăm, gel được sử dụng cho điện di protein có thể được chia nhỏ thành các phần gel tỷ lệ phần trăm và gel dẻo. Một tỷ lệ phần trăm gel cũng được gọi là gel tuyến tính Đối với gel tuyến tính, tỷ lệ phần trăm được chọn thường giảm từ 7,5% đến 20% . Các tỷ lệ phần trăm phổ biến đối với gel gradient là 4-15% và 10-20%. Mỗi loại gel có lợi thế riêng của nó. Ví dụ, gel tuyến tính được ưa thích hơn khi một số protein có trọng lượng phân tử tương tự; sự tách biệt tốt hơn giữa các protein này sẽ được hiển thị bằng một gel tuyến tính . Mặt khác, gradient gel là sự lựa chọn tốt hơn khi các mẫu quan tâm có chứa các protein có trọng lượng phân tử khác nhau hoặc bao phủ một lượng lớn trọng lượng phân tử
RNA markers
Chu trình gel agarose điện phân hiển thị một bậc thang RNA có dải ở một dải 281-6583 cặp base
Phát triển
Các thang RNA bao gồm các marker kích thước phân tử RNA được phát triển ban đầu bằng cách sử dụng phương pháp vòng tròn tổng hợp để tạo các dấu hiệu có kích thước khác nhau. Kỹ thuật này được cải tiến bởi nhà phát minh Eric T. Kool sử dụng các vec tơ DNA tròn là một phương pháp để tạo các marker kích thước phân tử RNA. Được gọi là phương pháp vòng tròn cán, những cải tiến của kỹ thuật này bắt nguồn từ hiệu quả của nó trong tổng hợp oligonucleotides RNA. Từ khuôn mẫu ADN tròn, ARN đơn sợi có chiều dài khác nhau từ 4-1500 BP có thể được sản xuất mà không cần primers và bằng cách tái chế nucleotide triphosphate. DNA cũng có thể được tổng hợp từ mẫu tròn, thêm vào tính linh hoạt của kỹ thuật này. So với phép sao chép dòng chảy, phương pháp vòng tròn tổng hợp tạo ra RNA oligonucleotides mà không có dòng chảy. So với PCR, phương pháp vòng tròn tổng hợp tạo ra RNA oligonucleotides mà không cần polymerase cũng không phải là một cycler nhiệt. Phương pháp này cũng hiệu quả về chi phí trong khả năng tổng hợp số lượng lớn sản phẩm với tỷ lệ lỗi thấp hơn máy tổng hợp
Thiết kế
Các dấu RNA bao gồm các bản ghi RNA có độ dài gia tăng khác nhau. Ví dụ: nhãn hiệu Lonza 0.5-9 kbp có các dải đánh dấu các cặp 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 và 9 kilobase. Chất đánh dấu được hòa tan trong bộ đệm lưu trữ, chẳng hạn như EDTA, và có thể có thời hạn sử dụng lên đến 2 năm khi lưu trữ ở -80 ° C. Để sử dụng marker, chẳng hạn như cho phân tích blot phía Bắc, nó là lần đầu tiên tan băng, và sau đó stained để nó có thể phát hiện trên gel điện di. Một trong những thuốc nhuộm phổ biến nhất được sử dụng để đánh dấu là ethidium bromide.
Phạm vi của một điểm đánh dấu đặc biệt đề cập đến nhiều dải mà nó có thể vẽ bản đồ. Phạm vi “cao” đề cập đến các đoạn tương đối lớn (được tính bằng kb) trong khi phạm vi “thấp” đề cập đến các dấu phân biệt giữa các đoạn nhỏ (đo bằng bp). Một số dấu hiệu thậm chí có thể được mô tả là “dải cực thấp”,, nhưng thậm chí chính xác hơn là các microRNA. Một marker microRNA có thể được sử dụng để đo các phân đoạn RNA trong vòng một chục nucleotide, chẳng hạn như microRNA 17-25 nt.
Sử dụng
Với trọng lượng phân tử tương đương, RNA sẽ di chuyển nhanh hơn DNA. Tuy nhiên, cả RNA và DNA đều có độ dốc tuyến tính âm giữa khoảng cách di chuyển của chúng và trọng lượng phân tử lôgarít. Tức là, các mẫu có trọng lượng ít hơn có thể di chuyển một khoảng cách lớn hơn. Mối quan hệ này là một sự cân nhắc khi lựa chọn RNA hoặc các marker DNA như một tiêu chuẩn.
Khi chạy marker RNA và các mẫu ARN trên gel, điều quan trọng là phải ngăn ngừa nhiễm bẩn nuclease, vì RNA rất nhạy cảm với sự thoái hoá ribonuclease (RNase) thông qua xúc tác Vì vậy, tất cả các vật liệu được sử dụng trong thủ tục phải được xem xét. Bất kỳ loại thủy tinh nào để tiếp xúc với RNA phải được xử lý trước bằng diethylpyrocarbonate (DEPC) và các vật liệu nhựa nên dùng một lần