Điện di gel của protein – Phần 1

Protein điện di là một phương pháp để phân tích các protein trong chất lỏng hoặc một chiết xuất. Electrophoresis có thể được thực hiện với một khối lượng nhỏ mẫu theo một số cách khác nhau có hoặc không có môi trường hỗ trợ: điện di gel polyacrylamide SDS (ngắn gọn: điện di gel, PAGE, hoặc điện di SDS), điện di động tự do, electrophocusing, isotachophoresis, điện di affinity, điện di miễn dịch, phản quang điện và điện di mao mạch. Mỗi phương pháp có nhiều biến thể với lợi thế và hạn chế riêng. Điện di gel thường được thực hiện kết hợp với electroblotting immunoblotting để cung cấp thêm thông tin về một protein cụ thể. Do những hạn chế thực tế, điện di protein thường không thích hợp như một phương pháp chuẩn bị.

Phương pháp gel denatu 
SDS-PAGE 
Bài chi tiết: SDS-PAGE
SDS-PAGE, điện cực gel polyacrylamide natri dodecyl sulfate, mô tả một tập hợp các kỹ thuật liên quan đến các protein riêng biệt theo tính di động điện di của chúng (một chức năng của chiều dài của một chuỗi polypeptide và điện tích của nó) trong khi ở trạng thái bị phân hủy. Trong hầu hết các protein, sự kết hợp của SDS với chuỗi polypeptit sẽ truyền tải thậm chí cả lượng trên một đơn vị khối lượng, do đó dẫn đến phân đoạn theo kích thước gần đúng trong quá trình điện di.

SDS là một chất tẩy rửa mạnh được sử dụng để làm biến đổi các protein bản địa để mở ra các polypeptit cá nhân. Khi một hỗn hợp protein được làm nóng đến 100 ° C với sự hiện diện của SDS, chất tẩy bao bọc xung quanh xương sống polypeptide. Trong quá trình này, các giá trị nội tại của các polypeptide trở nên không đáng kể so với các chi phí âm tính do SDS đóng góp. Do đó các polypeptide sau khi xử lý trở thành các cấu trúc giống như que có mật độ điện tích đồng nhất, đó là cùng một điện tích âm ròng trên một đơn vị chiều dài. Các điện di electrophoretic của các protein này sẽ là một chức năng tuyến tính của logarithms của trọng lượng phân tử của họ.

Các phương pháp gel nguyên bản 
Các gel tự nhiên, còn gọi là gel không denatur, phân tích các protein vẫn còn ở trạng thái nếp gấp của chúng. Do đó, tính di động của điện di phụ thuộc không chỉ phụ thuộc vào tỷ lệ tính-to-khối, mà còn về hình dạng vật lý và kích thước của protein.

Trang gốc màu xanh PAGE 
BN-PAGE là một kỹ thuật PAGE gốc, trong đó thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue cung cấp các chi phí cần thiết cho các phức chất protein để tách điện.  Bất lợi của Coomassie là gắn kết với các protein nó có thể hoạt động như một chất tẩy rửa làm cho các phức hợp phân ly. Hạn chế khác là khả năng ngưng tụ hóa học (ví dụ như trong việc phát hiện western blot hoặc các phép đo hoạt động) hoặc sự huỳnh quang của protein với các nhóm giả (ví dụ như heme hoặc chlorophyll) hoặc dán nhãn với thuốc nhuộm huỳnh quang.

Xóa trang gốc
CN-PAGE (thường được gọi là Native PAGE) tách axit hòa tan trong nước và các protein màng trong một gel gradient polyacrylamide. Nó không sử dụng thuốc nhuộm tích điện để di chuyển điện di của protein trong CN-PAGE (trái ngược với kỹ thuật thay đổi điện tích BN-PAGE) có liên quan đến điện tích nội tại của protein. Khoảng cách di chuyển phụ thuộc vào lượng protein, kích cỡ và kích thước lỗ của gel. Trong nhiều trường hợp, phương pháp này có độ phân giải thấp hơn BN-PAGE, nhưng CN-PAGE mang lại lợi ích bất cứ khi nào thuốc nhuộm Coomassie can thiệp vào các kỹ thuật phân tích khác, ví dụ như nó đã được mô tả như là một kỹ thuật tách vi phân rất hiệu quả cho các phân tích FRET. Ngoài ra CN-PAGE còn nhẹ hơn BN-PAGE vì vậy nó có thể giữ lại các tổ hợp siêu phân tử không bền của các phức hợp protein màng được tách ra theo các điều kiện của BN-PAGE.

Định lượng PAGE gốc 
Bài chi tiết: QPNC-PAGE

Ảnh chụp động điện thể hiện 4 lần chạy PAGE của protein cadmium có mật độ phân tử cao được làm mới bằng sắc ký học (≈ 200 ku) theo chức năng thời gian trùng hợp của gel (4% T, 2,67% C).
Các phức hợp protein nếp gấp được quan tâm rõ ràng và có thể tiên đoán được do tính chất hóa học và tính chất của gel polyacrylamide. Các protein tách ra liên tục được tách ra thành một chất tẩy rửa sinh lý và vận chuyển đến một bộ phận phân tích. Trong một số phân số PAGE cụ thể các đồng dẫn kim loại có thể được xác định và định lượng tuyệt đối bằng ICP-MS có độ phân giải cao. Các cấu trúc tự nhiên của các metalloprotein bị cô lập được làm sáng tỏ bằng phương pháp NMR giải pháp

Các ứng dụng y tế 

Sự biểu diễn của một protein điện di gel.

Electrophoresis protein huyết thanh cho thấy paraprotein (đỉnh trong vùng gamma) ở bệnh nhân đa u tủy.
Các bài báo chính: Điện di protein huyết thanh và protein máu
Trong y học, điện di protein là một phương pháp phân tích các protein chủ yếu trong huyết thanh. Trước khi sử dụng rộng rãi gel electrophoresis, protein điện di được thực hiện như tự do lưu lượng điện di (trên giấy) hoặc như immunoelectrophoresis.

Theo truyền thống, hai loại protein máu được xem xét: albumin huyết thanh và globulin. Nói chung chúng đều có tỷ lệ tương đương, nhưng albumin dưới dạng phân tử nhỏ hơn nhiều và nhẹ, tích điện âm, dẫn đến sự tích tụ albumin trên gel điện. Một ban nhạc nhỏ trước albumin đại diện cho transthyretin (còn gọi là prealbumin). Một số loại thuốc hoặc hóa chất cơ thể có thể gây ra ban nhạc riêng của họ, nhưng nó thường là nhỏ. Các dây thần kinh bất thường (đột biến) được thấy ở bệnh nhân có khối u monoclonal có ý nghĩa không xác định và u xơ đa u xơ và rất hữu ích trong việc chẩn đoán các tình trạng này.

Các globulin được phân loại theo mô hình dải (với các đại diện chính của chúng):

Dải alpha (α) bao gồm hai phần, 1 và 2:
α1 – α1-antitrypsin, glycoprotein α1-acid.
α2 – haptoglobin, α2-macroglobulin, α2-antiplasmin, ceruloplasmin.
Băng beta (β) – transferrin, LDL, bổ sung
Dải gamma (γ) – globulin miễn dịch (IgA, IgD, IgE, IgG và IgM). Paraprotein (ở u nguyên bào vẩy nhiều) thường xuất hiện trong dải này.
Thủ tục y khoa thông thường hiện nay bao gồm việc xác định nhiều protein trong huyết tương bao gồm hooc môn và enzyme, một số trong đó cũng được xác định bằng điện di. Tuy nhiên, điện di gel chủ yếu là một công cụ nghiên cứu, cũng như khi đối tượng là các protein trong máu.

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Scroll to Top