Laser electron tự do
Gần đây, các laser electron tự do đã được phát triển để sử dụng trong tinh thể học tia X. Đây là những nguồn tia X sáng nhất hiện có; với các tia X xuất hiện trong vụ nổ femto giây. Cường độ của nguồn là như vậy mà các mẫu nhiễu xạ phân giải nguyên tử có thể được giải quyết cho tinh thể nếu không quá nhỏ để thu thập. Tuy nhiên, nguồn sáng cường độ cao cũng phá hủy mẫu, đòi hỏi nhiều tinh thể được bắn. Vì mỗi tinh thể được định hướng ngẫu nhiên trong chùm tia, phải thu thập hàng trăm nghìn hình ảnh nhiễu xạ riêng lẻ để có được bộ dữ liệu hoàn chỉnh. Phương pháp này, kết tinh tinh thể femto giây, đã được sử dụng để giải quyết cấu trúc của một số cấu trúc tinh thể protein, đôi khi ghi nhận sự khác biệt với cấu trúc tương đương thu thập được từ các nguồn synchrotron
Ghi lại các phản xạ
Một mẫu nhiễu xạ tia X của một enzyme tinh thể. Mô hình điểm (phản xạ) và cường độ tương đối của mỗi điểm (cường độ) có thể được sử dụng để xác định cấu trúc của enzym.
Khi một viên pha lê được gắn và tiếp xúc với tia X cực mạnh, nó sẽ phân tán các tia X thành một mẫu các đốm hoặc phản xạ có thể quan sát được trên màn hình phía sau tinh thể. Một mô hình tương tự có thể được nhìn thấy bằng cách chiếu một con trỏ laser tại một đĩa compact. Các cường độ tương đối của các điểm này cung cấp thông tin để xác định sự sắp xếp các phân tử trong tinh thể trong chi tiết nguyên tử. Các cường độ của những phản xạ này có thể được ghi lại bằng phim ảnh, một máy dò diện tích hoặc với bộ cảm biến hình ảnh CCD tích hợp (charge-coupled device). Các đỉnh ở các góc nhỏ tương ứng với dữ liệu có độ phân giải thấp, trong khi các góc ở độ cao biểu diễn dữ liệu có độ phân giải cao; do đó, một giới hạn trên về độ phân giải cuối cùng của cấu trúc có thể được xác định từ những hình ảnh đầu tiên. Một số chất lượng nhiễu xạ có thể được xác định tại thời điểm này, chẳng hạn như hình ảnh của pha lê và rối loạn tổng thể của nó, như được quan sát thấy trong chiều rộng đỉnh. Một số bệnh lý của tinh thể mà làm cho nó không thích hợp để giải quyết các cấu trúc cũng có thể được chẩn đoán nhanh chóng vào thời điểm này.
Một hình ảnh của các điểm không đủ để tái tạo toàn bộ pha lê; nó chỉ đại diện cho một miếng nhỏ của biến đổi Fourier đầy đủ. Để thu thập tất cả các thông tin cần thiết, tinh thể phải được quay từng bước một thông qua 180 °, với một hình ảnh được ghi lại ở mỗi bước; trên thực tế, cần phải có hơn 180 ° để bao phủ không gian lẫn nhau, do độ cong của quả cầu Ewald. Tuy nhiên, nếu tinh thể có đối xứng cao hơn, có thể ghi lại một góc góc nhỏ hơn như 90 ° hoặc 45 °. Trục quay phải được thay đổi ít nhất một lần, để tránh phát triển một “điểm mù” trong không gian đối ứng gần trục quay. Thường là đá tinh thể một chút (0.5-2 °) để bắt một vùng rộng hơn của không gian đối ứng.
Nhiều bộ dữ liệu có thể là cần thiết đối với một số phương pháp phasing nhất định. Chẳng hạn, pha MAD đòi hỏi rằng sự tán xạ được ghi lại ít nhất ba bước sóng (và thường là bốn, cho sự thừa) của bức xạ tia X tới. Một tinh thể đơn lẻ có thể làm suy giảm quá nhiều trong quá trình thu thập một bộ dữ liệu, do tổn hại do bức xạ; trong những trường hợp như vậy, phải lấy dữ liệu về tinh thể nhiều.
Phân tích dữ liệu
Tinh thể đối xứng, di động đơn vị, và tỷ lệ hình ảnh
Thông tin thêm: Nhóm không gian
Các mô hình nhiễu xạ hai chiều được ghi lại, mỗi một tương ứng với một hướng tinh thể khác nhau, được chuyển đổi thành mô hình ba chiều của mật độ electron; chuyển đổi sử dụng kỹ thuật toán học của biến đổi Fourier, được giải thích dưới đây. Mỗi điểm tương ứng với một loại biến thể khác nhau trong mật độ electron; các nhà tinh chế phải xác định biến thể tương ứng với điểm nào (điểm), điểm mạnh tương đối của các điểm trong các hình ảnh khác nhau (hợp nhất và nhân rộng) và cách các biến thể nên được kết hợp để tạo ra mật độ điện tử tổng thể (phasing).
Xử lý dữ liệu bắt đầu với việc lập chỉ mục các phản xạ. Điều này có nghĩa là xác định kích thước của ô đơn vị và đỉnh ảnh nào tương ứng với vị trí nào trong không gian đối ứng. Một sản phẩm phụ của lập chỉ mục là xác định đối xứng của tinh thể, tức là nhóm không gian của nó. Một số nhóm không gian có thể được loại bỏ ngay từ đầu. Ví dụ, phản xạ đối xứng không thể được quan sát thấy trong các phân tử chiral; do đó, chỉ có 65 nhóm không gian 230 có thể cho phép đối với các phân tử protein gần như luôn luôn là chiral. Việc lập chỉ mục thường được thực hiện bằng cách sử dụng một thói quen tự động hóa.Sau khi được đối xứng được giao, dữ liệu sẽ được tích hợp. Điều này chuyển đổi hàng trăm hình ảnh chứa hàng ngàn phản xạ thành một tập tin, bao gồm các bản ghi của chỉ số Miller của mỗi lần phản chiếu, và một cường độ cho mỗi lần phản chiếu (ở trạng thái này, tệp tin thường bao gồm các ước lượng lỗi và các biện pháp của sự không thiên vị (phần nào của một sự phản ánh đã được ghi lại trên hình ảnh đó)).
Tập dữ liệu đầy đủ có thể bao gồm hàng trăm hình ảnh riêng biệt được chụp theo các hướng khác nhau của tinh thể. Bước đầu tiên là kết hợp và thu nhỏ những hình ảnh khác nhau, tức là xác định những đỉnh nào xuất hiện trong hai hoặc nhiều hình ảnh (hợp nhất) và để phóng to các hình ảnh tương đối sao cho chúng có quy mô cường độ nhất quán. Tối ưu hóa quy mô cường độ là rất quan trọng bởi vì cường độ tương đối của các đỉnh là thông tin quan trọng từ đó cấu trúc được xác định. Kỹ thuật lặp đi lặp lại của việc thu thập dữ liệu tinh thể và sự đối xứng cao của các vật liệu kết tinh làm cho máy đo nhiễu xạ ghi nhiều phản xạ tương đương đối xứng nhiều lần. Điều này cho phép tính toán R-factor đối xứng đối xứng, một chỉ số độ tin cậy dựa trên mức độ tương phản tương đương như các cường độ đo được của phản xạ tương đương, cần đánh giá chất lượng của dữ liệu.