Xây dựng mô hình và sàng lọc pha 

Khởi tạo ban đầu 
Thông tin thêm: Vấn đề pha
Các dữ liệu thu được từ thí nghiệm nhiễu xạ là một đại diện không gian đối ứng của lưới tinh thể. Vị trí của mỗi điểm nhiễu xạ được điều chỉnh bởi kích thước và hình dạng của ô đơn vị, và sự đối xứng cố hữu trong tinh thể. Cường độ của mỗi điểm nhiễu xạ được ghi lại, và cường độ này tỉ lệ với hình vuông của biên độ hệ số cấu trúc. Yếu tố cấu trúc là một số phức tạp bao gồm thông tin liên quan đến cả biên độ và pha của sóng. Để có được một bản đồ mật độ electron có thể diễn giải, cả biên độ và pha phải được biết đến (một bản đồ mật độ điện tử cho phép một nhà tinh chế tạo ra một mô hình khởi đầu của phân tử). Giai đoạn không thể được ghi lại trực tiếp trong một thí nghiệm nhiễu xạ: đây được gọi là vấn đề pha. Ước tính giai đoạn ban đầu có thể đạt được theo nhiều cách:

Phương pháp phân chia hoặc phương pháp trực tiếp Ab initio – Đây thường là phương pháp được lựa chọn cho các phân tử nhỏ (<1000 nguyên tử không phải hydrogen) và đã được sử dụng thành công để giải quyết các vấn đề về pha đối với các protein nhỏ. Nếu độ phân giải của dữ liệu tốt hơn 1.4 Å (140 giờ tối), các phương pháp trực tiếp có thể được sử dụng để lấy thông tin về giai đoạn, bằng cách khai thác các mối quan hệ giai đoạn đã biết giữa các nhóm phản xạ nhất định 115.
Thay thế phân tử – nếu một cấu trúc có liên quan được biết, nó có thể được sử dụng như là một mô hình tìm kiếm trong sự thay thế phân tử để xác định hướng và vị trí của các phân tử trong tế bào đơn vị. Các giai đoạn thu được theo cách này có thể được sử dụng để tạo ra các bản đồ mật độ electron.
Sự tán xạ tia X bất thường (MAD hoặc SAD phase) – bước sóng tia X có thể được quét qua một cạnh hấp thụ (khi được định nghĩa?) Của một nguyên tử, làm thay đổi sự tán xạ theo một cách được biết đến. Bằng cách ghi lại toàn bộ các phản xạ ở ba bước sóng khác nhau (ở dưới, trên và giữa cạnh hấp thụ), ta có thể giải quyết được cho các cấu trúc bên dưới của các nguyên tử nhiễu loạn dị thường và do đó cấu trúc của toàn bộ phân tử. Phương pháp phổ biến nhất để kết hợp các nguyên tử phân tán dị thường vào protein là để biểu hiện protein trong một methotine auxotroph (một máy chủ không thể tổng hợp methionine) trong một môi trường giàu seleno-methionine, có chứa các nguyên tử selenium. Một thí nghiệm MAD có thể được tiến hành xung quanh cạnh hấp thụ, sau đó sẽ tạo ra vị trí của bất kỳ dư lượng methionine trong protein, cung cấp các giai đoạn ban đầu. 
Phương pháp nguyên tử nặng (thay thế đa đẳng đẳng đẳng) – Nếu các nguyên tử kim loại có điện tử dày đặc có thể được đưa vào tinh thể, các phương pháp trực tiếp hoặc phương pháp không gian Patterson có thể được sử dụng để xác định vị trí của chúng và để có được giai đoạn ban đầu. Các nguyên tử nặng như vậy có thể được đưa ra bằng cách ngâm tinh thể trong dung dịch chứa nguyên tử nặng, hoặc bằng đồng kết tinh (phát triển tinh thể với sự có mặt của một nguyên tử nặng). Như trong pha MAD, những thay đổi trong biên độ tán xạ có thể được diễn giải để tạo ra các pha. Mặc dù đây là phương pháp ban đầu của các cấu trúc tinh thể bằng protein đã được giải quyết, nhưng phần lớn nó đã bị thay thế bởi pha chế MAD với selenometionine
Xây dựng mô hình và sàng lọc pha 

Một cấu trúc tinh thể protein ở độ phân giải 2,7 A. Lưới bao quanh khu vực trong đó mật độ electron vượt quá ngưỡng nhất định. Các phân đoạn thẳng biểu thị các liên kết hóa học giữa các nguyên tử không phải là hydro của arginine (trên trái), tyrosine (dưới bên trái), một liên kết disulfid (phía trên bên phải, màu vàng) và một số nhóm peptit (chạy bên trái ở giữa ). Hai ống cong màu xanh lá cây đại diện cho spline phù hợp với xương sống polypeptide.
Thông tin thêm: mô hình phân tử
Sau khi có được giai đoạn ban đầu, một mô hình ban đầu có thể được xây dựng. Mô hình này có thể được sử dụng để tinh chỉnh các giai đoạn, dẫn đến một mô hình cải tiến, v.v … Với mô hình của một số vị trí nguyên tử, các vị trí này và các yếu tố Debye-Waller tương ứng của chúng (hoặc các yếu tố B, cho phép chuyển động nhiệt của nguyên tử) có thể được tinh chế để phù hợp với dữ liệu nhiễu xạ đã quan sát, lý tưởng là tạo ra một tập các giai đoạn tốt hơn. Một mô hình mới sau đó có thể được phù hợp với bản đồ mật độ điện tử mới và một vòng tinh luyện hơn nữa được thực hiện. Điều này tiếp tục cho đến khi đạt được sự tương quan giữa dữ liệu nhiễu xạ và mô hình. Thỏa thuận được đo bằng một yếu tố R được định nghĩa là

R = \frac{\sum_{\mathrm{all\ reflections}} \left|F_{o} - F_{c} \right|}{\sum_{\mathrm{all\ reflections}} \left|F_{o} \right|}

trong đó F là hệ số cấu trúc. Một tiêu chuẩn chất lượng tương tự là Rfree, được tính từ một tập hợp con (~ 10%) các phản xạ không được bao gồm trong việc tinh chỉnh cấu trúc. Cả hai yếu tố R phụ thuộc vào độ phân giải của dữ liệu. Theo quy tắc chung, Rfree nên có độ phân giải xấp xỉ bằng angstrom chia cho 10; do đó, một bộ dữ liệu với độ phân giải 2 Å nên đưa ra một Rfree cuối cùng ~ 0.2. Các tính chất liên kết hóa học như cấu trúc, liên kết hydro và phân phối độ dài và góc trái phiếu là các biện pháp bổ sung về chất lượng mô hình. Giai đoạn giai đoạn là một vấn đề nghiêm trọng trong xây dựng mô hình lặp như vậy. Bỏ bản đồ là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để kiểm tra việc này.

Không thể quan sát mọi nguyên tử trong đơn vị bất đối xứng. Trong nhiều trường hợp, rối loạn làm mờ bản đồ mật độ điện tử. Những phân tử yếu như hydro là những chất vô hình thường thấy. Cũng có thể cho một nguyên tử đơn lẻ xuất hiện nhiều lần trong một bản đồ mật độ electron, ví dụ, nếu một protein sidechain có nhiều (<4) cho phép conformations. Trong các trường hợp khác, các nhà tinh thể học có thể phát hiện ra rằng cấu trúc cộng hóa trị đã suy luận cho phân tử là không chính xác hoặc thay đổi. Ví dụ, các protein có thể bị cắt hoặc trải qua các sửa đổi sau khi chuyển đổi mà không được phát hiện trước khi kết tinh.

Rối loạn
Một thách thức chung trong việc hoàn thiện cấu trúc tinh thể là do rối loạn tinh thể học. Rối loạn có thể có nhiều hình thức nhưng nói chung liên quan đến sự tồn tại của hai hoặc nhiều loài hoặc các hình dạng. Không nhận ra các kết quả rối loạn trong giải thích thiếu sót. Những sai lầm do mô hình hóa rối loạn không đúng được minh họa bằng giả thuyết chiết khấu của đồng phân giãn kéo dài . Rối loạn được mô hình hóa với sự liên quan đến dân số tương đối của các thành phần, thường chỉ có hai và bản sắc của chúng. Trong cấu trúc của các phân tử và ion lớn, dung môi và phản ứng thường bị rối loạn.

Sự lắng đọng của cấu trúc 
Một khi mô hình kết cấu của một phân tử đã được hoàn thành, nó thường được tích tụ trong cơ sở dữ liệu tinh thể như Cơ sở Kết cấu Kết cấu của Cambridge (cho các phân tử nhỏ), Cơ sở dữ liệu Kết cấu Tinh thể Vô cơ (ICSD) (cho các hợp chất vô cơ) hoặc Ngân hàng Dữ liệu Protein cho cấu trúc protein). Nhiều cấu trúc thu được trong các liên doanh thương mại tư nhân để kết tinh các protein có liên quan đến dược phẩm không được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu tinh thể công cộng.

Leave a Reply

Your email address will not be published.