Nhiệt độ Nhiệt độ Não Gel hóa học (TGGE) và Sự biến đổi điện hóa Gradient Gel (DGGE) là các dạng điện di sử dụng nhiệt độ hoặc gradient hóa học để làm biến dạng mẫu khi nó di chuyển qua một acrylamide gel. TGGE và DGGE có thể được áp dụng cho các axit nucleic như DNA và RNA, và (thường ít hơn) các protein. TGGE dựa vào các thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ trong cấu trúc để các axit nucleic riêng biệt. DGGE chia tách các gen có cùng kích thước dựa trên khả năng biến tính khác nhau được xác định bởi trình tự cặp base của chúng. DGGE là kỹ thuật ban đầu, và TGGE một sàng lọc về nó.
Lịch sử
DGGE được sáng tạo bởi Leonard Lerman, trong khi ông là giáo sư tại SUNY Albany
Cùng một thiết bị có thể được sử dụng để phân tích protein, được thực hiện lần đầu bởi Thomas E. Creighton thuộc Phòng thí nghiệm sinh học phân tử của MRC, Cambridge, Anh. Các mẫu tìm kiếm tương tự được tạo ra bởi các protein và axit nucleic, nhưng các nguyên tắc cơ bản là khá khác nhau.
TGGE lần đầu tiên được mô tả bởi Thatcher và Hodson và Roger Wartell của Georgia Tech. Công việc rộng rãi đã được thực hiện bởi nhóm Riesner ở Đức. Thiết bị thương mại cho DGGE có sẵn từ Bio-Rad, INGENY và CBS Scientific; một hệ thống cho TGGE có sẵn từ Biometra.
Nhiệt độ gradient gel electrophoresis
DNA có một điện tích âm và do đó di chuyển đến điện cực dương trong một điện trường. Gel là một lưới phân tử, với các lỗ có kích thước bằng với đường kính của chuỗi DNA. Khi một điện trường được sử dụng, ADN sẽ bắt đầu di chuyển qua gel, với tốc độ tỉ lệ nghịch với độ dài của phân tử ADN (các đoạn ADN đi nhanh hơn) – đây là cơ sở cho sự phân tách kích thước trong quá trình điện phân chuẩn .
Tuy nhiên, ở TGGE, cũng có một gradient nhiệt độ trên gel. Ở nhiệt độ phòng, DNA sẽ tồn tại ổn định dưới dạng sợi đôi. Khi nhiệt độ tăng, các sợi bắt đầu tách ra (nóng chảy), và tốc độ di chuyển qua gel giảm mạnh. Theo các nhà khoa học, nhiệt độ nóng chảy ở nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào trình tự (các bazaza GC ổn định hơn AT vì tương tác xếp chồng, không phải như thường nghĩ, do sự khác biệt trong liên kết hydro cytosine và guanine base, nhưng chỉ có hai giữa adenine và thymine), do đó, TGGE cung cấp một “phương pháp độc lập theo kiểu, độc lập” để tách các phân tử DNA. TGGE không chỉ phân tách các phân tử, mà còn cung cấp thêm thông tin về tính nóng chảy và sự ổn định (Biometra, 2000).
Denatura gradient gel electrophoresis
Điện di gel chuyển hóa gradient (DGGE) hoạt động bằng cách sử dụng một mẫu ADN nhỏ (hoặc RNA) vào gel điện di có chứa một tác nhân làm biến tính. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng một số gel biến tính có thể gây ra DNA để tan chảy ở các giai đoạn khác nhau. Do sự tan chảy này, DNA di chuyển qua gel và có thể được phân tích cho các thành phần đơn lẻ, thậm chí là các cặp nhỏ từ 200-700 cặp base.
Điều gì là duy nhất về kỹ thuật DGGE khi DNA đang bị điều kiện denatur cực kỳ nghiêm trọng, các đoạn tan chảy phân đoạn hoàn toàn thành các sợi đơn. Quá trình denaturation trên một gel biến tính rất sắc nét: “Thay vì tan chảy một phần theo kiểu dây kéo liên tục, hầu hết các mảnh vỡ tan trong một quá trình bước. Các phần rời rạc hoặc các vùng của đoạn đột nhiên trở thành một sợi đơn trong một phạm vi điều kiện biến tính hẹp “(Helms, 1990). Điều này cho phép phân biệt sự khác biệt trong chuỗi DNA hoặc sự biến đổi của các gen khác nhau: sự khác biệt về chuỗi trong các đoạn có cùng độ dài thường khiến chúng tan chảy ở các vị trí khác nhau trong gradient và do đó “dừng lại” ở các vị trí khác nhau trong gel. Bằng cách so sánh hành vi nóng chảy của các đoạn DNA đa hình cùng với các gel gradient biến tính, có thể phát hiện các mảnh có các đột biến trong miền nóng chảy đầu tiên (Helms, 1990). Đặt hai mẫu bên cạnh gel và cho phép chúng biến tính cùng nhau, các nhà nghiên cứu có thể dễ dàng nhận ra sự khác biệt nhỏ nhất trong hai mẫu hay các đoạn DNA.
Có một số bất lợi đối với kỹ thuật này: “Các gradient của chất hóa học như các chất được sử dụng trong DGGE không phải là có khả năng lặp lại được, rất khó thiết lập và thường không giải quyết hoàn toàn các dị tật” (Westburg, 2001). Những vấn đề này được giải quyết bởi TGGE, sử dụng nhiệt độ, chứ không phải là hóa chất, để làm biến dạng mẫu.