Method of TGGE
Để tách axit nucleic theo TGGE, phải thực hiện các bước sau:
Chuẩn bị và đổ gel – Vì phải lựa chọn một hệ thống đệm nên điều quan trọng là hệ thống sẽ ổn định trong điều kiện nhiệt độ tăng lên. Do đó, urê thường được sử dụng để chuẩn bị gel; tuy nhiên, các nhà nghiên cứu cần phải biết rằng lượng urê sử dụng sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ tổng thể cần thiết để tách DNA (Biometra, 2000).
Điện di – Gel được nạp, mẫu được đặt trên gel theo loại gel đang chạy – tức là song song hoặc vuông góc – điện áp được điều chỉnh và mẫu có thể để lại để chạy (Biometra, 2000). Tùy thuộc vào kiểu TGGE đang chạy, vuông góc hoặc song song, cần phải chuẩn bị và nạp mẫu khác nhau. Một lượng lớn hơn một mẫu được sử dụng với vuông góc, trong khi một số lượng nhỏ hơn nhiều mẫu được sử dụng với TGGE song song.
Nhuộm – Một khi gel đã được chạy, gel phải được nhuộm màu để hình dung các kết quả. Mặc dù có một số vết bẩn có thể được sử dụng cho mục đích này, việc nhuộm bạc đã chứng tỏ là công cụ hiệu quả nhất (Biometra, 2000).
Sự tinh khiết của DNA – DNA có thể được loại bỏ khỏi vết bạc để phân tích thêm thông qua khuếch đại PCR (Biometra, 2000).
Các ứng dụng
TGGE và DGGE rất hữu ích trong nghiên cứu sinh học và sinh thái; các ứng dụng đã chọn được mô tả dưới đây.
Các đột biến trong mtDNA
Theo một cuộc điều tra gần đây của Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper và Gropman, TGGE có thể được sử dụng để kiểm tra DNA ti thể của một cá nhân. Theo các tác giả này, TGGE đã được sử dụng để xác định hai đột biến mới trong bộ gen ty thể: “Một phụ nữ 21 tuổi bị nghi ngờ về cytopathy ty thể, nhưng tiêu cực cho các đột biến và ty thể di căn mitochondrial DNA (mtDNA) đã được sàng lọc vì các đột biến không rõ trong toàn bộ hệ gen ti thể của gel điện phân gradient nhiệt độ “(Wong và cộng sự, 2002).
đột biến p53 trong nước ép tụy
Lohr và cộng sự (2001) báo cáo rằng trong một nghiên cứu toàn diện về nước ép tuyến tụy của những người không có ung thư tuyến tụy, các đột biến p53 có thể được tìm thấy trong nước ép tụy của một tỷ lệ nhỏ người tham gia. Vì các đột biến p53 đã được tìm thấy rộng rãi trong ung thư tụy, các nhà nghiên cứu cho cuộc điều tra này đã cố gắng để xác định xem bản thân đột biến có thể được liên kết với sự phát triển của ung thư tuyến tụy. Trong khi Lohr đã có thể tìm thấy đột biến p53 thông qua TGGE trong một vài đối tượng, không có gì sau đó phát triển carcinoma tụy. Do đó, các nhà nghiên cứu kết luận bằng cách lưu ý rằng sự đột biến p53 có thể không phải là chỉ thị duy nhất cho sự hình thành ung thư biểu mô tuyến tụy.
Sinh thái vi sinh vật
DGGE của gen mã hóa tiểu đơn vị ribosome đã được Gerard Muyzer mô tả lần đầu tiên, trong khi ông là Post-doc tại Đại học Leiden, và đã trở thành một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong sinh thái vi sinh vật. PCR khuếch đại DNA được chiết xuất từ các cộng đồng vi sinh vật hỗn hợp với primer PCR đặc trưng cho các đoạn gen 16S rRNA của Bacteria và Archaea, và 18S rRNA đoạn gen của kết quả Eukaryotes trong hỗn hợp các sản phẩm PCR. Bởi vì các amplicon này có cùng độ dài, chúng không thể tách rời nhau bằng điện di gel agarose. Tuy nhiên, các biến thể của chuỗi (tức là sự khác nhau về hàm lượng GC và sự phân bố) giữa các rRNA vi khuẩn khác nhau dẫn đến các tính chất biến tính khác nhau của các phân tử DNA này. Do đó, các mô hình dải DGGE có thể được sử dụng để hình dung các biến thể đa dạng di truyền của vi sinh vật và cung cấp một ước tính sơ bộ về sự phong phú của sự phong phú của các thành viên vi khuẩn có ích. Phương pháp này thường được gọi là fingerprinting của cộng đồng. Gần đây, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng DGGE của các gen chức năng (ví dụ như các gen liên quan đến giảm lưu huỳnh, sự cố định đạm và sự oxy hoá ammonium) có thể cung cấp thông tin về chức năng vi sinh vật và chủng loại đồng thời. Ví dụ, Tabatabaei et al. (2009) đã áp dụng DGGE và đã khám phá ra mô hình vi sinh vật trong quá trình lên men k an khí cọ dầu cọ palm (POME) lần đầu tiên