Phép nhiễu tương phản huỳnh quang (FLIC) là một kỹ thuật vi mô phát triển để đạt được độ phân giải z trên thang đo nano mét.
FLIC xảy ra bất cứ khi nào các vật huỳnh quang ở gần bề mặt phản chiếu (ví dụ Si wafer). Sự va chạm kết quả giữa ánh sáng trực tiếp và ánh sáng phản chiếu dẫn đến việc điều chế cường độ gấp đôi I của vật thể huỳnh quang như là một hàm của khoảng cách, h, trên mặt phản chiếu. Điều này cho phép đo chiều cao nanomet.
Kính hiển vi FLIC rất phù hợp để đo địa hình của một màng chứa các đầu dò huỳnh quang ví dụ: một bilayer lipid nhân tạo, hoặc màng tế bào sống hoặc cấu trúc của các protein được đánh dấu huỳnh quang trên một bề mặt.
Thiết lập thử nghiệm
Một wafer silic thường được sử dụng làm bề mặt phản chiếu trong một thí nghiệm FLIC. Một lớp oxit sau đó được gia nhiệt trên phần trên của lớp silic wafer để hoạt động như một tấm đệm. Trên đỉnh ôxit được đặt mẫu có nhãn hiệu huỳnh quang, chẳng hạn như màng lipid, một tế bào hoặc màng tế bào bị ràng buộc. Với hệ thống mẫu được xây dựng, tất cả những gì cần là kính hiển vi phát hiện và một máy ảnh CCD để đo cường độ định lượng.
Đây là sơ đồ thí dụ thiết lập thử nghiệm FLIC với silic, ba lớp ôxít và một bilayer lipid có nhãn hiệu huỳnh quang (các sao vàng tượng trưng cho fluorophores.
Độ dày silicon dioxide rất quan trọng trong việc đo chính xác FLIC. Như đã đề cập trước đó, mô hình lý thuyết mô tả cường độ huỳnh quang tương đối so với độ cao của chất fluorophore. Vị trí của chất florua không thể đơn giản đọc được của một đường cong FLIC đơn đo. Thủ tục cơ bản là sản xuất lớp oxit với ít nhất hai độ dày đã biết (lớp có thể được tạo ra bằng kỹ thuật photolithographic và độ dày đo bằng phép đo điện môi). Độ dày được sử dụng phụ thuộc vào mẫu được đo. Đối với một mẫu có độ cao fluorophore trong phạm vi 10 nm, độ dày oxit khoảng 50 nm sẽ là tốt nhất vì đường cong cường độ FLIC là dốc nhất ở đây và sẽ tạo ra sự tương phản lớn nhất giữa độ cao fluorophore. Độ ô xít dày trên vài trăm nanomét có thể là vấn đề vì đường cong bắt đầu bị bôi đi bởi ánh sáng đa sắc và một dải các góc tới. Một tỷ lệ các cường độ huỳnh quang đo được ở các độ dày oxit khác nhau được so sánh với tỷ lệ dự đoán để tính chiều cao của chất fluorfore trên oxit
Phương trình trên có thể được giải quyết bằng số để tìm . Sự không hoàn hảo của thí nghiệm, chẳng hạn như phản xạ không hoàn hảo, tỷ lệ không bình thường của ánh sáng và ánh sáng đa sắc tố có xu hướng bôi ra các đường cong huỳnh quang sắc nét. Sự lan rộng trong góc độ tần số có thể được kiểm soát bằng khẩu độ số (N.A.). Tuy nhiên, tùy thuộc vào khẩu độ số được sử dụng, thí nghiệm sẽ mang lại độ phân giải dọc tốt (x-y) hoặc độ phân giải dọc tốt (z), nhưng không phải cả hai. Một N.A. cao (~ 1,0) cho độ phân giải tốt bên nếu tốt nhất là nếu mục tiêu là xác định địa hình dãy dài. Mặt khác N. N. thấp (~ 0.001) cung cấp phép đo chiều cao z chiều cao chính xác để xác định chiều cao của một phân tử được huỳnh quang trong một hệ thống.
Phân tích
Ví dụ về dữ liệu thực nghiệm thu thập được cho một mẫu có nhãn hiệu huỳnh quang trên 16 độ dày oxit. Lắp đường cong tới 16 điểm dữ liệu sẽ cho độ cao của fluorophores trên bề mặt oxit.
Các phân tích cơ bản liên quan đến việc thích hợp dữ liệu cường độ với mô hình lý thuyết cho phép khoảng cách của chất fluorophore trên bề mặt oxit ( một tham số miễn phí. Các đường cong FLIC chuyển sang bên trái do khoảng cách của chất fluorophore trên ôxít tăng lên. thường là tham số quan tâm, nhưng một số tham số miễn phí khác thường được bao gồm để tối ưu hóa sự phù hợp. Thông thường một yếu tố biên độ (a) và một thuật ngữ bổ sung liên tục cho nền (b) được bao gồm. Yếu tố biên độ làm tăng cường độ mô hình tương đối và nền liên tục làm thay đổi đường cong lên hoặc xuống để tính đến huỳnh quang phát ra từ các khu vực tập trung, chẳng hạn như phía trên cùng của tế bào. Đôi khi khẩu số (N.A.) của kính hiển vi được cho phép là một tham số tự do trong khớp nối. Các thông số khác vào lý thuyết quang học, chẳng hạn như các chỉ số khác nhau của khúc xạ, độ dày lớp và bước sóng ánh sáng, được giả định liên tục với một số không chắc chắn. Một con chip FLIC có thể được làm bằng các bậc thang oxit có 9 hoặc 16 chiều cao khác nhau được sắp xếp theo khối. Sau khi chụp một bức ảnh huỳnh quang, mỗi khối sân thượng 9 hoặc 16 sẽ tạo ra một đường cong riêng biệt FLIC xác định một duy nhất. Các giá trị trung bình được tìm thấy bằng cách biên dịch tất cả vào một biểu đồ.
Các lỗi thống kê trong tính toán của đến từ hai nguồn: lỗi trong phù hợp lý thuyết quang học với dữ liệu và sự không chắc chắn trong độ dày lớp oxit. Lỗi hệ thống được lấy từ ba nguồn: đo độ dày oxit (thường là bằng elipê), đo cường độ huỳnh quang bằng CCD, và sự không chắc chắn trong các thông số được sử dụng trong lý thuyết quang học. Lỗi hệ thống đã được ước tính là