Mẫu hỗn hợp được tách ra và phân tích được đưa vào trong một thể tích nhỏ riêng biệt (thường là microliters), vào trong dòng pha động di chuyển qua cột. Các thành phần của mẫu di chuyển qua cột tại các vận tốc khác nhau, là một chức năng của các tương tác vật lý cụ thể với chất hấp phụ (còn gọi là pha tĩnh). Vận tốc của mỗi thành phần phụ thuộc vào tính chất hóa học của nó, về bản chất của pha tĩnh (cột) và về thành phần pha động. Thời gian mà một chất phân tích cụ thể (xuất hiện từ cột) được gọi là thời gian lưu giữ của nó. Thời gian lưu giữ được đo theo các điều kiện đặc biệt là một đặc tính xác định của một chất phân tích nhất định.
Nhiều loại cột khác nhau có sẵn, chứa đầy các chất hấp phụ khác nhau về kích thước hạt và tính chất bề mặt của chúng (“hóa học bề mặt”). Việc sử dụng vật liệu đóng gói kích thước hạt nhỏ hơn đòi hỏi phải sử dụng áp suất hoạt động cao hơn (“áp suất phản ứng ngược”) và thường cải thiện độ phân giải (độ phân tách giữa các chất phân tích liên tiếp xuất hiện từ cột). Các hạt bụi có thể có tính chất k hydro nước hoặc cực.
Các pha di động thông thường được sử dụng bao gồm bất kỳ sự kết hợp có thể trộn lẫn nước với các dung môi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol). Một số kỹ thuật HPLC sử dụng các giai đoạn di động không có nước (xem phương pháp sắc ký bình thường ở dưới). Thành phần dung dịch nước trong pha động có thể chứa axit (như formic, phosphoric hoặc trifluoroacetic acid) hoặc muối để giúp tách các thành phần mẫu. Thành phần của pha di động có thể được giữ không đổi (“isocratic elution mode”) hoặc thay đổi (“gradient elution mode”) trong quá trình phân tích sắc ký. Isocratic elution thường có hiệu quả trong việc tách các thành phần mẫu rất khác nhau trong mối quan hệ của chúng đối với giai đoạn tĩnh. Trong quá trình tẩy gradient, thành phần của pha di động thay đổi từ sức mạnh tẩy từ thấp đến cao. Sức mạnh tách ra của pha động được thể hiện bằng thời gian lưu giữ của chất phân tích với độ bốc hơi nhanh (= thời gian lưu giữ ngắn). Một gradient điển hình trong quá trình sắc ký đảo ngược có thể bắt đầu ở 5% acetonitrile (trong nước hoặc dung dịch nước) và dần dần tuyến tính đến 95% acetonitril trong 5-25 phút. Các giai đoạn của thành phần giai đoạn di động liên tục có thể là một phần của bất kỳ độ dốc nào. Ví dụ, thành phần giai đoạn di động có thể được giữ không đổi ở 5% acetonitrile trong 1-3 phút, sau đó thay đổi tuyến tính lên đến 95% acetonitrile.
Thành phần đã chọn của pha điện thoại di động (còn gọi là eluent) phụ thuộc vào cường độ tương tác giữa các thành phần mẫu khác nhau (“chất phân tích”) và pha tĩnh (ví dụ tương tác k hydro nước trong HPLC đảo pha). Tùy thuộc vào ái lực của chúng đối với các giai đoạn tĩnh và di động phân tích phân chia giữa hai trong quá trình tách được diễn ra trong cột. Quá trình phân chia này tương tự như quá trình xảy ra trong quá trình tách chất lỏng và lỏng lẻo, nhưng không liên tục. Trong ví dụ này, sử dụng gradient nước / acetonitrile, các thành phần k hydro nước sẽ rửa sạch hơn (ăn ra khỏi cột), một khi pha động được tập trung nhiều hơn trong acetonitril (tức là trong một pha di động có độ bốc cao).
Việc lựa chọn các thành phần giai đoạn di động, các chất phụ gia (như muối hoặc axit) và các điều kiện gradient tùy thuộc vào tính chất của cột và các thành phần mẫu. Thông thường một loạt các chạy thử nghiệm được thực hiện với mẫu để tìm phương pháp HPLC cho phép phân tách đầy đủ