Lý thuyết
Sự tách rời HPLC có các tham số và phương trình lý thuyết để mô tả việc tách các thành phần thành các đỉnh tín hiệu khi được phát hiện bằng dụng cụ như máy dò UV hoặc quang phổ kế. Các tham số chủ yếu lấy từ hai bộ lý thuyết sắc ký lý: lý thuyết đĩa (như là một phần của sắc ký phân chia), và lý thuyết tỷ lệ của phương pháp sắc ký / Van Deemter. Tất nhiên, chúng có thể được đưa vào thực tế thông qua việc phân tích sắc ký đồ HPLC, mặc dù lý thuyết tỷ lệ được coi là lý thuyết chính xác nhất
Chúng tương tự như tính hệ số lưu giữ cho việc tách sắc ký bằng giấy, nhưng HPLC chia tách một hỗn hợp thành hai hay nhiều thành phần được phát hiện như các pic (dải) trên sắc ký đồ. Các thông số HPLC là: yếu tố hiệu quả (N), yếu tố duy trì (kappa prime), và yếu tố tách (alpha). Cùng nhau các yếu tố là các biến trong một phương trình giải thích, trong đó mô tả hai thành phần tốt như thế nào là các đỉnh được tách ra hoặc chồng lên nhau. Các thông số này chủ yếu được sử dụng để mô tả giai đoạn đảo ngược HPLC và sự phân tách pha bình thường của HPLC, vì những sự tách rời này có xu hướng tinh tế hơn các chế độ HPLC khác (ví dụ như trao đổi ion và loại trừ kích thước).
Void volume là lượng không gian trong một cột được chiếm bởi dung môi. Đó là không gian bên trong cột nằm bên ngoài vật liệu bao bì bên trong của cột. Void thể tích được đo trên sắc ký đồ khi phát hiện đỉnh đầu tiên, thường là dung môi có trong hỗn hợp mẫu; Lý tưởng nhất là dung môi mẫu chảy qua cột mà không tương tác với cột, nhưng vẫn có thể phát hiện được như là khác biệt so với dung môi HPLC. Khối lượng void được sử dụng như là một yếu tố hiệu chỉnh.
Hệ số hiệu quả (N) thực tế đo được mức độ sắc tố của sắc tố trên sắc ký đồ, tỷ số giữa diện tích đỉnh (“thời gian lưu giữ”) so với chiều rộng của đỉnh tại điểm rộng nhất của chúng (ở đường cơ sở). Các đỉnh cao, sắc nét, và tương đối hẹp cho thấy phương pháp tách có hiệu quả loại bỏ một thành phần từ hỗn hợp; Hiệu quả cao. Hiệu quả rất phụ thuộc vào cột HPLC và phương pháp HPLC được sử dụng. Yếu tố hiệu quả đồng nghĩa với số tấm, và “số lượng các tấm lý thuyết”.
Yếu tố duy trì (kappa prime) đo lường thời gian một thành phần của hỗn hợp dính vào cột, được đo bằng diện tích dưới đường cong của đỉnh của nó trên sắc ký đồ (vì sắc ký đồ HPLC là một hàm số của thời gian). Mỗi pic có sắc ký đồ sẽ có hệ số lưu giữ riêng (ví dụ kappa1 cho hệ số lưu giữ của đỉnh đầu tiên). Yếu tố này có thể được điều chỉnh cho khối lượng void của cột.
Hệ số phân tách (alpha) là so sánh tương đối về hai thành phần lân cận của hỗn hợp được tách ra như thế nào (tức là hai dải lân cận trên sắc ký đồ). Yếu tố này được xác định theo tỷ lệ của các yếu tố duy trì của một cặp đỉnh âm sắc lân cận và cũng có thể được điều chỉnh cho khối lượng void của cột. Càng nhiều yếu tố tách, thì việc tách càng tốt, cho đến khoảng 2.0 ngoài đó một phương pháp HPLC có thể không cần thiết để tách.
Các phương trình phân giải báo cáo ba yếu tố sao cho hiệu quả cao và các yếu tố tách biệt cải thiện độ phân giải của các đỉnh hợp phần trong một tách HPLC.