Khám phá
Kỹ thuật này được phát minh bởi Grant Henry Lathe và Colin R Ruthven, làm việc tại Bệnh viện Queen Charlotte, London. Sau đó, họ nhận được giải thưởng John Scott cho sáng chế này. Trong khi Lathe và Ruthven sử dụng gel tinh bột làm ma trận, Jerker Porath và Per Flodin sau đó đã đưa ra các gel dextran, các loại gel khác với các tính chất phân tách kích thước bao gồm agarose và polyacrylamide. Một đánh giá ngắn về những phát triển này đã xuất hiện.
Họ cũng đã cố gắng phân đoạn các polyme cao tổng hợp; tuy nhiên, chỉ đến năm 1964, khi JC Moore của Công ty Hóa chất Dow công bố công trình của ông về việc chuẩn bị các sắc ký tinh gel permeation (GPC) dựa trên polystyrene liên kết với kích thước lỗ điều khiển, cho thấy sự gia tăng nhanh chóng của nghiên cứu hoạt động trong lĩnh vực này bắt đầu. Nó đã được công nhận gần như ngay lập tức với việc hiệu chuẩn thích hợp, GPC đã có thể cung cấp thông tin phân phối khối lượng mol và phân tử mol cho các polyme tổng hợp. Bởi vì thông tin thứ hai khó có được bằng các phương pháp khác, GPC đã nhanh chóng sử dụng rộng rãi.
Lý thuyết và phương pháp
Các cột SEC dựa trên Agarose được sử dụng để tinh chế protein trên một máy AKTA FPLC.
SEC được sử dụng chủ yếu để phân tích các phân tử lớn như protein hoặc polyme. SEC hoạt động bằng cách bẫy các phân tử nhỏ hơn trong các lỗ của hấp thụ vật liệu hấp phụ (“pha tĩnh”). Quá trình này thường được thực hiện với một cột, trong đó bao gồm một ống rỗng chứa chặt với các hạt polyme xốp cực nhỏ được thiết kế để có các lỗ có kích cỡ khác nhau. Những lỗ chân lông này có thể là các hiện tượng trầm cảm trên bề mặt hoặc các kênh thông qua hạt. Khi giải pháp di chuyển xuống cột một số hạt đi vào các lỗ rỗng. Các hạt lớn hơn không thể xâm nhập được nhiều lỗ chân lông. Các hạt lớn hơn, nhanh hơn elution. Các phân tử lớn hơn đơn giản đi qua các lỗ chân lông vì các phân tử này quá lớn để đi vào các lỗ. Các phân tử lớn hơn do đó chảy qua cột nhanh hơn các phân tử nhỏ hơn, nghĩa là, phân tử nhỏ hơn, thì thời gian lưu giữ càng lâu.
Một yêu cầu đối với SEC Là chất phân tích không tương tác với bề mặt của các giai đoạn văn phòng phẩm, với sự khác biệt về thời gian rửa giải giữa chất phân tích lý tưởng được nếu chỉ dựa vào khối lượng chất tan các chất phân tích có thể nhập, chứ không phải tương tác hóa học hoặc điện với các giai đoạn tĩnh. Do đó, một phân tử nhỏ có thể xâm nhập vào bất kỳ vùng nào của hệ thống lỗ chân không cố định có thể vào một thể tích tổng cộng bằng tổng khối lượng lỗ và khối lượng của khối. phân tử nhỏ này elutes muộn (sau khi phân tử đã thâm nhập tất cả các pore- và interparticle khối lượng-Khoảng 80% khối lượng cột). Ở thái cực khác, một phân tử rất lớn không thể xâm nhập bất cứ que các lỗ chân lông nhỏ hơn có thể chỉ nhập số lượng interparticle (~ 35% khối lượng cột) và elutes trước Khi số tiền này của giai đoạn di động đã đi qua cột. Nguyên tắc cơ bản của SEC là các kích cỡ khác nhau (lọc) thông qua một pha tĩnh tại các mức khác nhau. Điều này dẫn đến việc tách một giải pháp của các hạt dựa trên kích thước. Với điều kiện là tất cả các hạt đều được nạp đồng thời hoặc gần cùng một lúc, các hạt cùng kích thước nên được làm sạch với nhau.
Tuy nhiên, có những biện pháp khác nhau về kích thước của các đại phân tử (ví dụ, bán kính của gyration và bán kính thủy động lực học), các vấn đề cơ bản trong lý thuyết của SEC đã được lựa chọn kích thước thông số thích hợp phân tử của các phân tử nào khác các loại được tách ra. Về mặt thực nghiệm, Benoit và các đồng nghiệp tìm thấy sự tương quan tuyệt vời giữa khối lượng rửa trôi và kích thước phân tử động lực, thể tích thủy động lực, đối với một số cấu trúc chuỗi khác nhau và các thành phần hóa học. Sự tương quan quan sát được dựa trên khối lượng thuỷ động lực đã được chấp nhận trên cơ sở hiệu chuẩn của SEC toàn cầu.
Tuy nhiên, việc sử dụng khối lượng thuỷ động lực, kích thước dựa trên đặc tính động, trong việc giải thích dữ liệu SEC không được hiểu đầy đủ . Điều này là do SEC thường chạy dưới điều kiện tốc độ dòng chảy thấp mà hệ số thủy động lực nên có ít ảnh hưởng đến sự tách rời. Trong thực tế, cả lý thuyết và mô phỏng máy tính giả định nguyên tắc tách nhiệt động lực học: quá trình tách được xác định bởi sự phân bố cân bằng (phân vùng) của các đại phân tử chất tan giữa hai giai đoạn — loãng giai đoạn giải pháp số lượng lớn nằm ở không gian và giải pháp giai đoạn kẽ giới hạn Trong vòng các lỗ rỗng của vật liệu bao bì cột. Dựa trên lý thuyết này, nó đã được chỉ ra rằng tham số kích thước có liên quan đến việc phân chia các polyme trong các lỗ chân lông là kích thước trung bình span. Mặc dù vấn đề này vẫn chưa được giải quyết trọn vẹn, rất có thể khoảng nhịp trung bình và khối lượng thủy động lực học tương quan mạnh mẽ.
Mỗi cột loại trừ kích thước có một loạt các trọng lượng phân tử có thể được tách ra. Giới hạn loại trừ xác định trọng lượng phân tử ở đầu trên của dải ‘làm việc’ cột và là nơi các phân tử quá lớn để bị mắc kẹt trong pha tĩnh. Sự kết thúc dưới của dải được xác định bởi giới hạn thấm, xác định trọng lượng phân tử của một phân tử đủ nhỏ để xâm nhập vào tất cả các lỗ của pha tĩnh. Tất cả các phân tử dưới khối lượng phân tử này quá nhỏ đến mức chúng được tách như một băng đơn lẻ
Dung dịch lọc được thu thập ở cuối gọi là eluat. Thể tích void bao gồm bất kỳ hạt nào quá lớn để vào môi trường, và thể tích dung môi được gọi là thể tích cột.